الوسط المكيف للأعضاء: توليد وسط من خلايا الأعضاء المحصودة لدراسات السرطان النقيلي

الملخص

المصدر: Piaseczny ، M. M. ، et al. توليد الوسائط المكيفة للأعضاء والتطبيقات لدراسة التأثيرات الخاصة بالأعضاء على السلوك النقيلي لسرطان الثدي. J. Vis. Exp. (2016).

يصف هذا الفيديو طريقة لتوليد وسط مكيف للأعضاء مشتق من كبد الفأر. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتحديد ودراسة العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الأعضاء وتأثيراتها على استحاء الأعضاء والسلوك النقيلي للخلايا السرطانية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد الوسائط المكيفة للرئة والدماغ

1. في غطاء مزرعة الأنسجة المعقم ، قم بقلب أنابيب PBS التي تحتوي على الرئة أو الدماغ ثلاث مرات لإزالة الدم المتبقي من الأعضاء وشفط PBS المحتوي على الدم. كرر العملية باستخدام PBS البارد الطازج حتى يظهر المحلول واضحا مع عدم وجود دليل على وجود دم.
2. ضع الرئتين والأدمغة في أطباق بتري زجاجية منفصلة مقاس 60 مم 2. باستخدام شفرتين معقمتين من المشرط ، قم بفرم الرئتين أو الأدمغة عن طريق التقطيع بشكل متكرر ذهابا وإيابا حتى يصبح حجم شظايا الأنسجة ~ 1 مم 3 تقريبا.
3. حدد كمية الوسائط اللازمة لإعادة تعليق شظايا الأنسجة من فرق الوزن المحسوب.
   ملاحظه: يتم تطبيع وزن أنسجة الرئة والمخ عن طريق إعادة التعليق في نسبة الوسائط 4: 1: الأنسجة (الحجم / الوزن).
4. أعد تعليق شظايا الأنسجة بالحجم المناسب (المحدد سابقا في الخطوة 1.3) من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM): وسائط F12 مكملة بمكملات ميتوجين مركزة 1x والبنسلين (50 ميكروغرام / مل) / ستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل).
5. أضف شظايا أنسجة الرئة أو المخ المعلقة إلى بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار.
6. احتضان شظايا الأنسجة في الوسائط لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. بعد الحضانة ، اجمع الوسائط المكيفة لكل نسيج وقم بتخفيفها بشكل أكبر عن طريق إضافة ثلاثة أحجام مكافئة من الوسائط الطازجة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
7. جهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم في وسائط مكيفة مخففة لكل عضو عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة بقايا الأنسجة الكبيرة. اجمع المادة الطافية للوسائط وقم بالتصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
تجمع
8. الوسائط المكيفة من كل عضو (أي الرئة مع الرئة والدماغ مع الدماغ) من الفئران المتعددة لحساب التباين من الفأر إلى الفأر. Aliquot وتخزين الوسائط المكيفة عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات ثيرموفيشر العلمي 10010-023 حافظ على معقمة 60 مم 2 أطباق بتري زجاجية سيجما ألدريتش CLS7016560 حافظ على معقمة DMEM: F12 تقنيات الحياة هاتف: 21331-020 دافئ في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ، والحفاظ على معقم البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) تقنيات الحياة 15140-122 حافظ على معقمة 50 مل أنابيب مخروطية الشكل العلم الحراري (Nunc) 339652 حافظ على معقمة مرشحات حقنة 0.22 ميكرومتر سيجما ألدريتش Z359904 حافظ على معقمة 6 ألواح زراعة الأنسجة العلم الحراري (Nunc) 140675 حافظ على معقمة شفرات مشرط فيشر ساينتيك S95937A حافظ على معقمة