< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير الأنسجة المتجانسة
تشريح - الأنسجة المقطوعة (الأنسجة الخبيثة والطبيعية المستقطعة من غرفة العمليات) موجودة في مختبر علم الأمراض من قبل موظفين مدربين للالتقاط الفوري. تتم معالجة الورم و NANT (الأبعد مسافة من الورم قدر الإمكان) وشظايا الأنسجة الطبيعية بشكل روتيني في غضون 1-3 ساعات من الاستئصال الجراحي في مختبر BSL2 باستخدام إجراءات السلامة البيولوجية القياسية للأنسجة البشرية. يتم توضيح مخطط انسيابي للبروتوكول في الشكل 1.
- قم بوزن جميع شظايا الأنسجة (طبيعي ، NANT والورم) وقم بقياس الطول والعرض والارتفاع (الطول × العرض × الارتفاع). هذه خطوة مهمة للتطبيع اللاحق للمجموعات السكانية الفرعية للخلايا ، والحمض النووي الريبي المستخرج ، وما إلى ذلك <br / >
ملاحظه: نطاق حجم العينة من 100 إلى 10,000 مم3 بدون دهون إن أمكن.
- قم ببصمة جزء الورم على شريحة زجاجية لتلوين H&E للتحقق من أن الأنسجة هي في الواقع جزء من الورم.
- افعل ذلك عن طريق الضغط على شريحة مجهر زجاجي على جزء الورم والضغط برفق بأصابعك لبضع ثوان.
- ثبت الشريحة مع الأيزوبروبانول لمدة 2 دقيقة متبوعة بخطوة غسيل في الماء. قم بتلطيخ الأنسجة لمدة 30 ثانية باستخدام هيماتوكسيلين ماير.
- اغسل الشريحة في ستة حمامات من الماء. بقعة في الفلوكسين ب 2٪ لمدة 15 ثانية.
- يغسل في حمام واحد من الماء متبوعا بأربعة حمامات من الأيزوبروبانول وانتهي بحمام واحد من الماء.
- احتضن في الأيزوبروبانول لمدة 1 دقيقة ثم صفيها. واضح في حمامين من الزيلين.
- جبل مع وسيط تركيب قائم على الزيلين. فحص خلية الورم (الشكل 2).
ملاحظه: بشكل أساسي ، تلتصق الخلايا السرطانية بالشريحة المطبوعة - نادرا ما تبقى الخلايا اللحمية أو اللمفاوية أو الدهنية ، تاركة مسافات بين الخلايا السرطانية (الشكل 2).
- ضع جزء الأنسجة في طبق مزرعة صغير يحتوي على 1 مل من وسط الخلية المكونة للدم المحدد كيميائيا والخالي من المصل (المشار إليه فيما يلي باسم المتوسط) في درجة حرارة الغرفة وقم بتقطيعه إلى قطع صغيرة (~ 1 - 2 مم2) باستخدام مشرط معقم.
- انقل كل شيء (شظايا الأنسجة + الوسط) إلى أنبوب C للفصل الميكانيكي.
- اشطف طبق بتري والمشرط ب 2 مل من الوسط باستخدام ماصة باستور وأضفها إلى الأنبوب C (حجم الوسط للتفكك = 3 مل).
- استخدم برنامج الفصل الميكانيكي A.01 للأنابيب C (البرنامج الأكثر لطفا) لتجانس شظايا الأنسجة في معلق خلية واحدة. ضع الأنبوب C في الجهاز وقم بتشغيل البرنامج مرتين متتاليتين (دورة واحدة = 25 ثانية).
ملاحظه: تم إنشاء إجراء التجانس هذا والتحقق من صحته لأنسجة الثدي البشري ، وقد تحتاج أنواع الأورام أو الأنسجة الأخرى إلى استخدام برنامج مختلف ويجب اختباره أولا.
- قم بإزالة الأنبوب C من الجهاز وصب التجانس مباشرة في مصفاة خلية 40 ميكرومتر مثبتة على أنبوب سعة 50 مل. باستخدام نفس ماصة باستور كما في الخطوة 1.6، انقل أي سائل متبقي في الأنبوب C إلى مصفاة الخلية.
- انقل السائل المصفى إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة دقيقة سعة 1 مل. احتفظ مؤقتا بمصفاة الخلية وأنبوبها سعة 50 مل.
- اشطف الأنبوب C ب 3 مل إضافية من الوسط وانقله، مرة أخرى باستخدام نفس ماصة باستور كما في الخطوة 1.6، إلى مصفاة الخلية التي لا تزال مثبتة على أنبوب سعة 50 مل. اضغط على أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي المحاصر في الأنسجة غير المتجانسة في أنبوب سعة 50 مل عن طريق تحريكه برفق حول المصفاة باستخدام ماصة باستور نظيفة أو طرف 1 مل يتم التخلص منه لاحقا لتجنب تلويث الشطف.
- ضع مصفاة الخلية رأسا على عقب على الأنبوب C الأصلي واشطفها ب 3 مل من الوسط حتى تسقط الأنسجة غير المتجانسة مرة أخرى في الأنبوب C.
- إعادة التجانس كما في الخطوة 1.7 لدورتين من برنامج A.01.
- صب هذا المتجانس الثاني من خلال مصفاة الخلية الموجودة على أنبوب 50 مل ، واشطف الأنبوب C مرة أخرى بوسط 3 مل (كما في الخطوة 1.10) ونقله باستخدام ماصة باستور إلى مصفاة الخلية الموجودة على أنبوب 50 مل مرة أخرى مع الضغط على أكبر قدر ممكن من السائل من النسيج الضام المتبقي المحاصر في مصفاة الخلية.
- في هذه المرحلة ، يوجد حجم ~ 2.5 مل في أنبوب 15 مل و ~ 9 مل في أنبوب 50 مل.
< p class = "jove_title" >2. فصل الأنسجة الطافية والخلايا
- الطرد المركزي المتجانسات في أنابيب 15 مل و 50 مل لمدة 15 دقيقة عند 600 × جم في درجة حرارة الغرفة.
- صب SN من أنبوب 15 مل في أنبوب نظيف وتخزينه مؤقتا عند 4 درجات مئوية. يتم توضيح هذا المادة الطافية = الورم الأولي أو NANT أو SN للأنسجة الطبيعية (الحجم النهائي 2.5 مل) لاحقا وتقسيسه قبل التخزين عند -80 درجة مئوية للتحليلات المستقبلية (انظر أدناه).
- تخلص من المادة الطافية من أنبوب 50 مل.
- أعد تعليق كل من الكريات الخلية برفق في حجم نهائي من 1 مل متوسط. باختصار, أولا كسر حبيبات الخلية برفق في كلا الأنبوبين (عن طريق النقر على الأنبوب على سطح صلب). أعد تعليق حبيبات الخلية السائبة في 50 مل مع 500 ميكرولتر من الوسط وانقل معلق الخلية هذا إلى أنبوب 15 مل لإعادة تعليق الحبيبات الثانية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع 500 ميكرولتر ثانية من الوسط لتحقيق أقصى قدر من التعافي من الخلايا.
- انقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب صغير ، واخلطه مع 10 ميكرولتر من تريبان الأزرق (التخفيف 1: 1) واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم.
ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن أيضا تحليل جزء من تعليق الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي لتقييم حجم الخلية والحبيبات وإذا رغبت في ذلك ، هناك عدد محدود من علامات السكان الفرعيين لتقييم أكثر دقة لتوزيع الخلايا النسبي في المتجانس قبل التحليل أو التجريب المكثف. تتضمن جميع التحليلات عن طريق قياس التدفق الخلوي وضع العلامات CD45 لتطبيع المجموعات السكانية الفرعية.
- حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الخلايا من الورم أو NANT أو الأنسجة الطبيعية جاهزة الآن لمزيد من التنقية أو التحليل. هذه الخطوات الإضافية هي الأفضل عند إجراؤها في نفس يوم الجراحة.
ملاحظه: لتحليل قياس التدفق الخلوي ولكن ليس فرز الخلايا ، يجب تحلل خلايا الدم الحمراء المتبقية بعد وضع العلامات على الأجسام المضادة عن طريق إضافة 0.4 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء إلى حبيبات الخلية ، والدوامة على الفور لمدة ثانية واحدة واحتضان ما لا يقل عن 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (محمية من الضوء) قبل التحليل.
< p class = "jove_title" >3. توضيح الأنسجة الطافية
- جهاز الطرد المركزي الأنابيب سعة 1.5 مل مع الأنسجة SN عند 15,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون لمس الحبيبات أو إزعاجها. انقله إلى أنبوب نظيف (أو أنابيب) حسب عدد وحجم الحصص المطلوبة.
- قم بتخزين المادة الطافية عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
