مقايسة تكوين مستعمرة أجار الناعمة: طريقة لاختبار تأثيرات المركبات الجديدة على تكاثر الخلايا السرطانية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Horibata A. et al. ، استخدام مقايسة تكوين مستعمرة أجار الناعمة لتحديد مثبطات الأورام في خلايا سرطان الثدي. J. Vis. Exp. (2015).

يصف هذا الفيديو مقايسة تكوين مستعمرة أجار ناعمة لاختبار تأثيرات مثبط إنزيم PADI و BB-Cl-amidine على أورام سرطان الثدي في المختبر. يتيح هذا الاختبار أيضا التقييم الكمي لإمكانات تحول الخلية في سياق الاضطرابات الجينية.

البروتوكول

فئة < ص = "jove_title" >1. تحضير 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل أغاروز

1. في زجاجة زجاجية نظيفة وجافة سعة 100 مل ، أضف 0.9 جم من 2-هيدروكسي إيثيل أغاروز (Agarose VII) متبوعا ب 30 مل من الماء المقطر.
2. ضعي المزيج في الميكروويف لمدة 15 ثانية ولفيه برفق. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أخرى على الأقل حتى يذوب مسحوق الاغاروز تماما.
3. قم بتعقيم الزجاجة المحتوية على المحلول لمدة 15 دقيقة.
4. اترك محلول الاغاروز يبرد إلى RT قبل الاستخدام مرة أخرى. قم بتخزين الحل في RT.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الطبقة السفلية: 0.6٪ جل الاغاروز

1. قم بتسخين عدة ماصات سعة 5 مل و10 مل مسبقا في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمنع اللاغاروز من التصلب في الماصة عند المناولة.
2. قم بفك غطاء الزجاجة جزئيا وقم بتسخين محلول 2-هيدروكسي إيثيل الاغاروز المعدة مسبقا بنسبة 3٪ لمدة 15 ثانية. بعد ذلك ، حرك المحلول برفق والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى.
   أنذر: كن حذرا عند تحريك محلول الاغاروز لأن المحلول يرتفع عند تعرضه للهواء ويمكن أن ينسبت.
3. إذا كان هناك هلام صلب متبقي في الزجاجة ، فقم بالميكروويف لبضع ثوان أخرى.
4. احتفظ بالزجاجة التي تحتوي على محلول الاغاروز في حمام مائي 45 درجة مئوية خلال الخطوات التالية لمنع محلول الاغاروز من التصلب قبل الأوان.
قم
5. بتسخين وسائط MCF10DCIS في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   ملاحظه: تتكون MCF10DCIS الوسائط من DMEM / F12 ، مصل حصان 5٪ ، 5٪ بنسلين ستربتومايسين.
6. انقل 3 مل من محلول الاغاروز 3٪ باستخدام الماصات المسخنة مسبقا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
7. أضف على الفور 12 مل من وسائط MCF10DCIS الدافئة واقلب الأنبوب المخروطي برفق لخلط الاغاروز مع الوسائط. حاول ألا تشكل أي فقاعات لأنها ستتداخل مع عد المستعمرة لاحقا.
8. أضف 2 مل من هذا الخليط برفق في كل بئر من صفيحة ثقافة مكونة من 6 آبار دون تكوين أي فقاعات هواء.
9. احتضان لوحة الاستزراع المكونة من 6 آبار أفقيا على سطح مستو عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة للسماح للخليط بالتصلب.
10. بعد أن يتماسك الخليط ، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة السفلية جاهزة الآن للاستخدام.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الطبقة المحتوية على الخلية: 0.3٪ جل الاغاروز

1. قم بتربسين الخلايا MCF10DCIS وتخفيفها إلى تركيز خلية 4 × 10⁴ / مل.
2. خذ 2 مل من 3٪ agarose باستخدام ماصات مسخنة مسبقا وانقله إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
3. أضف على الفور 8 مل من وسائط MCF10DCIS إلى الأنبوب المخروطي واقلبها برفق لخلط الاغاروز مع الوسائط. تجنب تكوين أي فقاعات.
4. خذ 2 مل من الخلايا MCF10DCIS (4 × 10⁴ / مل) وعالجها باستخدام BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
5. في تخفيف 1: 1 ، امزج الخلايا مع 0.6٪ agarose.
6. خذ 1 مل من خليط الخلية والأغاروز وأضفه برفق إلى الطبقة السفلية من صفيحة الثقافة المكونة من 6 آبار (2 × 10⁴ خلايا / مل).
7. ضع لوحة الاستزراع المكونة من 6 آبار أفقيا على سطح مستو عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للطبقة العليا بالتصلب.
8. بعد أن يصلب الخليط ، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة أسبوع قبل إضافة طبقة التغذية.

فئة

4. تحضير طبقة التغذية: 0.3٪ جل الاغاروز

1. قم بتسخين محلول 3٪ 2-Hydroxyethyl agarose المصنوع مسبقا في الميكروويف لمدة 15 ثانية ، وحرك المحلول برفق والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى.
2. قم بتوازن زجاجة محلول الاغاروز في حمام مائي 45 درجة مئوية.
3. قم بتسخين وسائط MCF10DCIS في حمام مائي 37 درجة مئوية.
4. امزج 1 مل من محلول الاغاروز 3٪ مع 9 مل من وسائط MCF10DCIS الدافئة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واقلبها برفق لخلط الاغاروز مع الوسائط. تجنب تكوين فقاعات الهواء.
5. عالج الخليط ب BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
6. أضف 1 مل من هذا الخليط برفق (دون تكوين فقاعات) في كل بئر من صفيحة الثقافة المكونة من 6 آبار التي تحتوي على القاع والطبقات الناعمة.
7. ضع لوحة الاستزراع المكونة من 6 آبار أفقيا على سطح مستو عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للخليط بالتصلب.
8. بعد أن تصلب طبقة التغذية ، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية.
9. كرر إجراء التغذية هذا أسبوعيا عن طريق تراكب 1 مل من محلول الاغاروز / المتوسط / المعالجة بنسبة 0.3٪ على طبقة التغذية الحالية لتجديد الخلايا بوسائط جديدة حتى يتم ملاحظة تكوين المستعمرة.
   ملاحظه: الأجار في الطبقات الناعمة والمغذية ناعم جدا ، وبالتالي ، فإن العناصر الغذائية المضافة من طبقة التغذية ستنتشر بسهولة في الطبقة المحتوية على الخلية للوصول إلى الخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات زايس أكسيوبوت الفحص المجهري لكارل زايس 1021859251 مجهر مقلوب أوليمبوس CKX41 DMEM / F-12 لونزا بيوويتاكر 12-719 فهرنهايت HyClone المتبرع مصل الخيول فيشر ساينتيك SH30074.03 البنسلين ستربتومايسين تقنيات الحياة 15140-122 2-هيدروكسي إيثيل غاروز: النوع السابع ، درجة حرارة التبلور المنخفضة سيجما ألدريتش 39346-81-1