حقن وريد الذيل: طريقة لإدارة الخلايا السرطانية للدراسات النقيلية في نموذج الفأر

الملخص

المصدر: Warren et al. ، الاستخدام المشترك لمقايسات ورم خبيث في الوريد الذيل والتصوير في الوقت الفعلي في الجسم الحي لتحديد الاستعمار النقيلي لسرطان الثدي والعبء في الرئتين. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تقنية حقن الخلايا السرطانية المصنفة باستخدام حقن وريد الذيل في نموذج الفأر. نراقب أيضا سرطان الثدي ، وتكوين ورم خبيث ، ونموه باستخدام تصوير الحية في الوقت الفعلي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. حقن الوريد الذيل للخلايا السرطانية المصنفة

ملاحظة: تم تحسين الخطوة 1.2.4 لخلايا 4T1 التي تنمو في الفئران BABB / c المتجانسة. إذا تم استخدام خطوط الخلايا السرطانية الأخرى وسلالات الفئران ، فيجب أولا تحسين عدد الخلايا المحقونة وطول المقايس.

1. قم بتوسيع خطوط الخلايا 4T1 المتولدة في الخطوة 2 على طبقين مقاس 15 سم في وسط نمو كامل بحيث تتوفر الخلايا الزائدة في يوم الحقن.
2. تحضير الخلايا لحقن وريد الذيل على النحو التالي:
   1. استنشق الوسائط واشطف ألواح الخلايا باستخدام 1x PBS.
   2. قم بتربسين الخلايا ب 5 مل من التربسين لكل طبق 15 سم لمدة 2-5 دقائق (يجب أن تشطف الخلايا قاع البئر بحرية). انقل جميع الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل. اغسل الخلايا المتبقية من طبق زراعة الأنسجة بوسائط نمو كاملة كافية لإرواء التربسين وإضافة الغسيل إلى نفس الأنبوب المخروطي.
   3. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي لتحديد العدد الإجمالي للخلية.
   4. الطرد المركزي للخلايا عند 122 × جم لمدة 3 دقائق ، وشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1x PBS بالتركيز المطلوب. هنا ، يتم حقن 2.5 × 10⁴ خلايا في كل فأر في 100 ميكرولتر من PBS ، وبالتالي فإن الخلايا المعلقة عند 2.5 × 10⁵ خلايا / مل. احتفظ بتعليق الخلية على الجليد حتى الحقن.
      ملاحظة: من المهم تحديد مقدار الوقت بين التربسينية للخلايا وحقن وريد الذيل إلى حوالي 1 ساعة.
3. حقن خلايا 4T1 من الخطوة 1.2.5 في الفئران عبر وريد الذيل الجانبي على النحو التالي:
   1. العمل في غطاء في منشأة ، امزج الخلايا برفق ولكن جيدا عن طريق قلب الأنبوب أو استخدام حقنة سعة 1 مل لضمان تعليقها بشكل موحد. تأكد دائما من إعادة تعليق الخلايا قبل تحميل المحقنة.
   2. قم بتحميل حقنة قفل Luer سعة 1 مل مع تعليق الخلية وطرد فقاعات الهواء الزائدة. ضع إبرة قياس 1/2 بوصة على المحقنة مع شطبة لأعلى وطرد فقاعات الهواء.
   3. ضع الماوس برفق في مصفاة القوارض.
   4. يجب أن تكون أوردة الذيل الجانبية مرئية ومتوسعة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضغط برفق على قاعدة الذيل واغمس الذيل في ماء الصنبور الدافئ لتوسيع الأوردة.
      ملاحظه: يمكن أيضا تحقيق تمدد الأوردة عن طريق وضع قفص الماوس تحت مصباح التدفئة و / أو فوق وسادة التدفئة.
   5. استخدم مناديل كحولية لتنظيف الذيل. أدخل الإبرة في وريد الذيل ، بحيث يكون الجانب المائل لأعلى ، وحقن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية.
      ملاحظه: إذا تم إدخال الإبرة بشكل صحيح في الوريد ، فيجب أن تنزلق بسهولة إلى الأمام والخلف قليلا ، ويجب ألا تكون هناك مقاومة عند دفع المكبس. يجب أن تؤدي الحقن الناجحة أيضا إلى "تدفق" حيث يتحول اللون الأزرق للوريد إلى اللون الأبيض لبضع ثوان بعد الحقن.
4. قم بإزالة الإبرة ببطء وباستخدام شاش معقم ، واضغط على موقع الحقن لوقف أي نزيف.
5. أعد الماوس إلى قفصه ومراقبه لمدة 15 دقيقة لضمان الشفاء التام. يجب فحص الفئران بحثا عن علامات الألم أو الضيق 3 مرات أسبوعيا.
6. راقب الفئران بحثا عن تكوين ورم خبيث ونموه لمدة 3-6 أسابيع (يعتمد على خط الخلية وسلالة الفأر) باستخدام جهاز تصوير الحية في الجسم الحي (انظر الخطوتين 1.5 و 1.6).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2.5٪ تريبسين جيبكو 15090-046 التربسين لزراعة الأنسجة مناديل الكحول لتعقيم موقع الحقن قبل إنجيسيتونات وريد الذيل الفئران BALB / C (أنثى ، 6 أسابيع) تاكونيك بلب-ف للاستعمار النقيلي في الوريد الذيل ومقايسات العبء Dulbecco&39; S محلول ملحي مخزن بالفوسفات هايميديا تي إس 1006 EDTA VWR 97061-406 يستخدم لتخفيف التربسين لزراعة الأنسجة FBS 100٪ من أصل أمريكي VWR هاتف: 97068-085 مكون من وسائط النمو الكاملة ل-جلوتامين جيبكو هاتف: 25030-081 مكون من وسائط النمو الكاملة خلايا سرطان الثدي في الفئران ، 4T1 معهد كارمانوس للسرطان أسلاكسون ، سي جيه وآخرون ، 1992 فأر النقيلي الثدي cance خط الخلية البنسلين ستربتومايسين جيبكو 15140-122 مكون من وسائط النمو الكاملة