تضخم الرئة الكاملة: طريقة لإعداد الرئتين للتصوير الحي خارج الجسم الحي

الملخص

المصدر: Van den Bijgaart R.J.E. et al. ، Ex vivo Live Imaging of the Lungasis the Lupressis and the Microenvironments ، J. Vis. Exp. (2016)

يصف هذا الفيديو طريقة لإعداد الرئتين للتصوير الحي خارج الجسم الحي لدراسة التفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية ، باستخدام الاغاروز للتضخم. في بروتوكول العينة ، يتم وصف إجراء تضخم الاغاروز قبل مراقبة التفاعلات الخلوية الحية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تحضير الرئتين للتصوير الحي خارج الجسم الحي

ملاحظة: حاول العمل بأكبر قدر ممكن من العقيم والحذر لتجنب التحديات غير الضرورية للخلايا المناعية داخل الرئتين.

1. حقن الفأر داخل الصفاق (IP) بجرعة زائدة مميتة من مخدر مسموح به بموجب بروتوكول المعتمد من IACUC ، على سبيل المثال ، 1 مل من 2.5٪ أفيرتين. انتظر حتى يتوقف الفأر عن التنفس ويكون غير مستجيب تماما للمنبهات الضارة (قرصة المخلب الخلفي).
   ملاحظة: يجب تجنب خلع عنق الرحم والقتل الرحيم بثاني أكسيد الكربون لأنه يمكن أن يؤثر بشكل ضار على بقاء خلايا الرئة.
2. شل حركة الماوس على لوحة تشريح وتعقيم الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. استخدم المقص الجراحي لعمل شق شرسوفي عرضي أولا عبر الجلد ، يليه شق مماثل عبر الصفاق. امسك لوحة التشريح في وضع رأسي وقم بقطع الشريان الأورطي الهابط ، بحيث يتجمع الدم في البطن وليس في تجويف الصدر.
4. قص فتحة صغيرة في الحجاب الحاجز لتحرير الفراغ. قم بقص الضلع 10 و 12 لاستئصال الحجاب الحاجز والوصول البصري إلى الرئتين.
5. استخدم مقصا جراحيا لقطع الجلد حتى القصبة الهوائية فوق القفص الصدري ولكن اترك القفص الصدري سليما. افصل الجلد عن القفص الصدري. كشف القصبة الهوائية عن طريق إزالة النسيج الضام المحيط ، مع الحرص على عدم إتلاف القصبة الهوائية نفسها (الشكل 1 أ).
6. قص فتحة صغيرة قطرها حوالي 1 مم في القصبة الهوائية المكشوفة الموازية للحلقات الغضروفية ، بالقرب من الحنجرة قدر الإمكان (الشكل 1 ب). احرص على عدم قطع القصبة الهوائية بالكامل.
7. خذ إبرة 20 جم وأدخل الإبرة برفق 4-5 مم في القصبة الهوائية دون أي قوة مضادة (الشكل 1 د). يجب أن تكون نهاية الإبرة مرئية من خلال القصبة الهوائية (الشكل 1 ج). استخدم الملقط لتثبيت الإبرة في القصبة الهوائية. بدلا من ذلك ، يمكن ربط خياطة حول القصبة الهوائية لتثبيت الإبرة في مكانها.
   ملاحظة: عن طريق الإدخال العميق جدا ، قد تصاب الكارينا بصدمة أو قد ينتفخ جانب واحد فقط من الرئتين.
8. املأ حقنة ب 400 ميكرولتر من 37 درجة مئوية 2٪ أغاروز بدرجة حرارة انصهار منخفضة (مأخوذة مباشرة من حمام بدرجة حرارة ثابتة). تأكد من أن لوحة التشريح واقفة وغرس الاغاروز الدافئ ببطء من خلال الإبرة في الرئتين ، واستخدم ~ 400 ميكرولتر لتضخيم الرئتين.
   ملاحظة: شاهد الرئتين تنتفخ داخل القفص الصدري. لا تفرط في تضخيم الرئة لأنها ستتمزق.
9. بمجرد نفخ الرئتين ، املأ ~ 2/3 من القفص الصدري ، افصل المحقنة واحتفظ بالإبرة داخل القصبة الهوائية لمنع تسرب أي أغروز.
10. صب ما يقرب من 50 مل من 20 درجة مئوية PBS على الرئتين المنتفختين للسماح للأغاروز داخل الرئتين بالثبات والتصلب. قم بإزالة الإبرة ببطء وأغلق القصبة الهوائية بالملقط لمنع تسرب أي أغاروز غير صلب.
11. كشف الرئتين عن طريق إجراء بضع القص ثم استئصال الرئتين لاحقا. لاستئصال الرئتين ، تمسك بالقصبة الهوائية أثناء قطع القصبة الهوائية تماما. اسحب القصبة الهوائية برفق لأعلى ، وقطع النسيج الضام والمريء أثناء سحب الرئتين من تجويف الصدر حتى يتم فصل الرئتين عن الفأر (الشكل 1E).
12. اغمر الرئتين في RPMI-1640 الدافئ لغسل الدم الزائد وفصل الفصوص برفق باستخدام المقص والملقط لقطع الشعب الهوائية الجذعية الرئيسية للفصوص عند النقير (الشكل 1F).
13. ضع الفصوص ، مع السطح المسطح لأسفل لزيادة سطح التصوير إلى أقصى حد ، في بئر من لوحة تصوير مكونة من 24 بئرا (الشكل 1G). أضف 100 ميكرولتر من 37 درجة مئوية RPMI-1640 فوق الفصوص. ضع عدة شرائح لغطاء المجهر الدائري مقاس 15 مم أعلى الفصوص لمنعها من الطفو.
14. صب PBS الدافئ في الآبار المحيطة لمنع وسائط RPMI-1640 من التبخر. أدخل الصفيحة المكونة من 24 بئرا في غرفة المناخ المتوازنة وحافظ على فصوص الرئة عند 37 درجة مئوية بالهواء و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. أدخل غرفة المناخ على مسرح المجهر متحد البؤر.
    ملاحظة: يمكن أيضا النظر في مخاليط الغاز الأخرى (على سبيل المثال ، 5٪ O₂ ، 5٪ CO₂ في N₂ لفحص سلوك الخلية في ظل ظروف نقص الأكسجة / انخفاض الأكسجين).

النتائج

الشكل 1. بروتوكول لإعداد الرئتين للتصوير الحي.(أ) تعرض القصبة الهوائية بعد تحضير الفأر. (ب) قصاصة صغيرة مصنوعة في القصبة الهوائية المكشوفة موازية للحلقات الغضروفية. (ج) إبرة 20 جم يتم إدخال 4-5 مم في القصبة الهوائية. (د) تقطير 400 μلتر 2٪ من الاغاروز بدرجة حرارة انصهار منخفضة في الرئتين. (ه) ا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مخدر غير أ غير أ التخدير المعتمد من IACUC ، يستخدم للتخدير و / أو القتل الرحيم PBS ، USP معقم شركة أمريسكو K813-500 مل درجة فائقة النقاء للحقن الوريدي 1X برنامج تلفزيوني مرفق زراعة الخلايا UCSF غير أ منصة الستايروفوم غير أ غير أ سيتم استخدامه كلوحة تشريح مقص ناعم حاد أدوات العلوم الدقيقة 14060-11 20 جم × 1 إبرة ، شطبة قصيرة دينار بحريني 305178 ملقط متجر روبوز الجراحي RS-5135 1 مل حقنة بدون إبرة دينار بحريني 309659 الاغاروز بدرجة حرارة انصهار منخفضة لونزا 50111 م لعمل 10 مل من المحلول ، قم بوزن 0.2 غرام من الاغاروز ، وأضفه إلى 10 مل 1 × PBS ، وسخنه حتى يذوب. سوف يتجمد الاغاروز في درجة حرارة الغرفة ، لذا يحفظ في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يستخدم للنفخ. RPMI-1640 متوسط بدون فينول أحمر تقنيات الحياة 11835-030 24 لوحة تصوير بئر علمية E&K إك - 42892 شرائح غطاء زجاجي، 15 مم فيشر ساينتيك 22-031-144 ثاني أكسيد الكربون الرقمي والتحكم في درجة الحرارة أوكولاب DGTCO2BX http://www.oko-lab.com غرفة المناخ أوكولاب غير أ http://www.oko-lab.com مراقب الخلية المجهر متحد البؤر القرص الدوار زييس غير أ هواء جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو غير أ أكسجين جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو غير أ ثاني أكسيد الكربون جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو غير أ