1. مرور واستزراع خلايا TUM622 في الثقافات ثنائية الأبعاد
- وسط ثقافة ثلاثي الأبعاد دافئ وكواشف تفكك الخلايا (انظر جدول المواد) لخلايا TUM622 عند 37 درجة مئوية.
- مرور خلايا TUM622 عند التقاء 80٪ في قوارير ثنائية الأبعاد. عادة ، يحدث هذا بعد أسبوع واحد من المرور.
- تخلص من الوسط القديم من قارورة T75 واغسلها مرة واحدة باستخدام 6 مل من محلول HEPES. تجنب سحب العينة مباشرة على الخلايا.
- استنشاق المخزن المؤقت HEPES. أضف 4 مل من التربسين / EDTA (0.25 مجم / مل ، انظر جدول المواد) لشطف سريع وتخلص من التربسين / EDTA.
- أضف 2 مل من التربسين / EDTA واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة القوارير من الحاضنة واضغط على القوارير لفك الخلايا دون تكوين فقاعات هواء وأعد القوارير إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق إضافية.
ملاحظه: سيؤدي التعرض المطول للتربسين إلى إتلاف الخلايا بشكل لا رجعة فيه وتغيير نمطها الظاهري ، وبالتالي يوصى بالحد من الوقت الذي تتعرض فيه الخلايا للتربسين.
- تأكد من انفصال الخلايا وانفصالها تحت مجهر ضوئي (4x أو 10x). أضف 4 مل من المخزن المؤقت للتحييد (المخزن المؤقت TNS) (انظر معلومات كاشف الزراعة الفرعية في جدول المواد) متبوعا ب 10 مل من وسط الاستزراع ثلاثي الأبعاد (انظر جدول المواد).
- الماصة لأعلى ولأسفل برفق لفصل الخلايا بشكل أكبر باستخدام ماصة سعة 10 مل. انقل المعلق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
- عد أرقام الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي.
- البذور 0.8 × 106 خلايا / قارورة T75 في 20 مل من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد (انظر جدول المواد).
- قم بتغذية الخلايا كل يومين عن طريق استبدال نصف الوسط المستهلك بوسط جديد.
< p class = "jove_title" >2. طلاء خلايا TUM622 في المصفوفة خارج الخلية للزراعة ثلاثية الأبعاد
- في اليوم السابق للتجربة ، قم بإذابة قوارير مصفوفة الغشاء القاعدي في ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل. ماصات بلاستيكية للتهدئة (2 مل) وأطراف عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظه: ليس كل الكثير من مصفوفة الغشاء القاعدي لها نفس القدرة على دعم النمو ثلاثي الأبعاد لخلايا TUM622. لذلك ، من الضروري الحصول على عدة مجموعات من مصفوفة الغشاء القاعدي واختبارها لتحديد تلك التي تدعم تكوين الأسيني القوي. عادة ، يتطلب هذا تركيزا أعلى من البروتين (16-18 مجم / مل) في المصفوفة.
- في يوم التجربة ، وسط ثقافة ثلاثي الأبعاد دافئ ، عازلة HEPES ، التربسين / EDTA ومخزن تحييد التربسين (TNS) في حمام مائي 37 درجة مئوية. مباشرة قبل إعداد المزرعة ، أخرج مصفوفة الغشاء القاعدي المذابة من الثلاجة وضع القارورة على الثلج.
- قم بتبريد ألواح زراعة الأنسجة على مبرد منصة معدنية موضوعة على الجليد. ضع أنابيب الطرد المركزي على رف تبريد معدني على الجليد.
- باستخدام خلايا TUM622 التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.7 ، احسب العدد المطلوب من الخلايا اللازمة للطلاء. عادة ، هناك حاجة إلى 15,000-30,0000 خلية لكل بئر من صفيحة 24 بئرا. الكثافة المنخفضة هي الأنسب للتصوير والقياس الكمي ، بينما تفضل الكثافة العالية عند جمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي أو النشاف الغربي.
- انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مبرد (يحتوي كل أنبوب على خلايا للطلاء ثلاثي النسخ) وقم بالدوران عند 300 × جم في جهاز طرد مركزي دلو معلق عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة شفط متصلة بطرف غير مفلتر (20 ميكرولتر)، مع ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر من الوسط في الأنبوب (استخدم العلامات الموجودة على الأنبوب كدليل).
- اضغط برفق على جانب الأنبوب لإزاحة الحبيبات وفصلها قبل إعادتها إلى رف التبريد.
- باستخدام الماصات المبردة مسبقا سعة 2 مل، امزج المصفوفة برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات مع إبقاء القارورة على اتصال بالثلج. الماصة بسرعة متساوية ومعتدلة بحيث لا يتم إدخال فقاعات في المصفوفة أثناء هذا الإجراء.
- انقل الحجم المناسب للمصفوفة إلى كل أنبوب طرد مركزي. لطلاء ثلاث نسخ في صفيحة 24 بئرا ، أضف 1.1 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى كل أنبوب.
- باستخدام أطراف مبردة مسبقا ، قم بعمل الماصة في كل أنبوب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات لعمل تعليق خلوي موحد.
- انقل 310 ميكرولتر من تعليق الخلية / المصفوفة إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا مبردة مسبقا. يتم وضع الماصة بزاوية 90 درجة على سطح اللوحة ويضاف التعليق إلى وسط البئر. يجب أن ينتشر التعليق ويغطي البئر بالكامل دون الحاجة إلى إمالة اللوحة.
- لتسهيل تحليل التألق المناعي في اتجاه مجرى النهر ، قم بوضع تعليق الخلية / المصفوفة بالتوازي في شرائح غرفة 2 بئر. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية / المصفوفة إلى وسط بئر من شريحة غرفة 2 بئر (انظر جدول المواد). هذا يسمح للمصفوفة بتشكيل هيكل يشبه القبة بحجم أصغر بكثير.
- أعد اللوحة وانزلق الغرفة مرة أخرى إلى حاضنة زراعة الأنسجة واحتضانها لمدة 30 دقيقة للسماح للمصفوفة بالتصلب. افحص اللوحة / الشريحة تحت المجهر الضوئي للتأكد من توزيع الخلايا المفردة بالتساوي داخل المصفوفة (4x أو 10x).
- أضف 1 مل من الوسط الكامل للثقافة ثلاثية الأبعاد الدافئة مسبقا في كل بئر و 1.5 مل من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد إلى كل بئر من شريحة الغرفة ثم أعدها إلى الحاضنة.
