فحص استخراج الحمض النووي الريبي: طريقة لاستخراج الحمض النووي الريبي من خلايا سرطان الرئة المنقولة miRNA

الملخص

المصدر: Hossian ، A. K. M. N. et al. ، تحليل علاجات miRNA التوافقية لتنظيم دورة الخلية وتكوين الأوعية. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي من خلايا سرطان الرئة المنقولة miRNA. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد نشاط علاج miRNA الاندماجي في وقف دورة الخلية وتكوين الأوعية.

البروتوكول

1. تعداء miR-143 و miR-506

تنبيه: استخدم قفازات اللاتكس والنظارات الواقية ومعطف المختبر أثناء إجراء التجارب الموصوفة. عند الحاجة ، استخدم خزانة السلامة الحيوية مع تشغيل مروحة الخزانة ، دون سد الشعب الهوائية أو إزعاج تدفق الهواء الرقائقي. اضبط النافذة الزجاجية الواقية دائما على الارتفاع المناسب ، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.

خلايا
1. البذور NSCLC A549 في T25 سم² قارورة / 6/96 صفيحة بئر في وسائط DMEM / F12K مكملة ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (وسط الاستزراع) في غطاء زراعة الأنسجة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في حاضنة زراعة الأنسجة.
2. قم بتعليق miR-143 و / أو miR-506 ، أو تقليد siRNA مع عامل التعدي (تم خلط 2.4 ميكروغرام من miR مع 14 ميكرولتر من عامل التعدي ؛ انظر جدول المواد) في 500 ميكرولتر من وسائط التعدي و 1.5 مل من وسائط المصل ووسائط DMEM / F12K الخالية من المضادات الحيوية بتركيز نهائي من miRNA يبلغ 100 نانومتر. قد تتطلب كمية miRNA التحسين على الخلايا والتركيزات المختلفة. تشمل الأساليب المناسبة تعدي الخلايا بتركيزات متزايدة من miRNA (أي 50-200 نانومتر) وتقييم تقليل تنظيم التعبير للجينات ذات الأهمية.
3. قم بإزالة وسائط الثقافة من القارورة / اللوحة واغسلها مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
4. أضف مجمعات عامل miRNA / التدافع واحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 6 ساعات (يحدد حجم القارورة حجم الحضانة المضاف).
5. استبدل الوسائط ب 4 مل من وسائط الاستزراع واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة و / أو 48 ساعة.
6. حصاد الخلايا المنقولة عن طريق التربسين ، عن طريق إضافة 1 مل من التربسين-EDTA في كل قارورة T25 سم² ، واحتضانها لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وإضافة 3 مل من وسائط الاستزراع لحصاد الخلايا. ضع محتويات كل قارورة في أنبوب منفصل سعة 15 مل. العمل في غطاء لزراعة الأنسجة.
7. جهاز طرد مركزي عند 751 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية
   ملاحظه: يجب توخي الحذر أثناء إزالة المادة الطافية ، لأن تحريك الأنبوب قد يتسبب في فقدان الخلايا.
8. أضف 2 مل من 1x PBS وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 751 × جم.
9. كرر الخطوتين 7 و 8 مرة واحدة لإزالة أي آثار للوسائط والمواد الطافية.
   ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين أنابيب العينة عند -80 درجة مئوية أو يمكن استخدامها على الفور.

فئة

2. استخراج الحمض النووي الريبي

1. نظف منطقة العمل عن طريق الرش بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ ومحلول إزالة التلوث من RNAse.
2. يجب إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة الحمض النووي الريبي المناسبة (انظر جدول المواد).
3. قم بإزالة الأنابيب من -80 درجة مئوية واتركها تذوب. أضف 300 ميكرولتر من محلول التحلل والماصة لأعلى ولأسفل لكسر غشاء الخلية.
4. أضف حجما متساويا من الإيثانول فائق النقاء بنسبة 100٪.
5. تخلط جيدا وتوضع في عمود الفصل.
6. جهاز طرد مركزي بين 11 و 16 × جم لمدة 30 ثانية وإزالة التدفق.
7. أضف 400 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت والطرد المركزي لإزالة المخزن المؤقت.
8. أضف 5 ميكرولتر من DNAse I مع 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم الحمض النووي في كل عينة واحتضنه لمدة 15 دقيقة.
9. اغسل العينة ب 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعداد الحمض النووي الريبي.
10. اغسل 2x باستخدام مخزن غسيل الحمض النووي الريبي.
11. أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي ، ثم اجمع الحمض النووي الريبي.
12. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات A549 خلايا سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة ATCC ATCC CCL-185 أمبيون كاتم الصوت التحكم السلبي رقم 1 siRNA أمبيون AM4611 هاس-مير-143-3 ب miRNA مقلد ABM MCH01315 هاس-مير-506-3p miRNA مقلد ABM MCH02824 مصل الأبقار الجنينية (FBS) فيشر ساينتيك 10438026 HyClone فوسفات المحلول الملحي المخزن (PBS) فيشر ساينتيك SH30256FS DMEM 4.5 جم / لتر جلوكوز ، مع بيروفات الصوديوم ، مع L/ Glutamine VWR VWRL0100-0500 ماء مقطر خال من Invitrogen UltraPure DNase / RNase إنفيتروجين 10-977-015 أطقم الحمض النووي الريبي السريع زيمو للأبحاث R1055 الإيثانول ، المطلق (200 برهان) ، درجة البيولوجيا الجزيئية ، فيشر الكواشف الحيوية BP2818500 -80 درجة مئوية فريزر VWR VWR40086A نانودروب الترمو: العلمية نانو دروب واحد ج 96 لوحة بئر سيلتريت العلمية 50-607-511 البنسلين الستربتومايسين 10/10 أنتلانتا بيولوجيكس ب 21210 حاضنة CO2 الترمو: العلمية HERAcell 150i دناسي زيمو للأبحاث E1010 خليط المغذيات F-12K (Kaighn's Mod.) مع L-glutamine ، Corning كورنينج 45000-354 مصل الأبقار الجنينية - بريميوم أنتلانتا بيولوجيكس S11150 ماتيشين الطرد المركزي الذي يتم التحكم فيه في درجة الحرارة الترمو: العلمية ST16R تسيطر على درجة الحرارة مايكرو الطرد المركزي المايشين إيبندروف 5415 ص