تحليل دورة الخلية: نهج لدراسة تنظيم دورة الخلية لخلايا سرطان الرئة المنقولة بواسطة miRNA

الملخص

المصدر: Hossian ، A. K. M. N. ، وآخرون. تحليل علاجات miRNA التوافقية لتنظيم دورة الخلية وتكوين الأوعية.J. Vis. Exp.(2019).

miRNA أو microRNA هي المنظمين الرئيسيين لتقدم دورة الخلية. يصف هذا الفيديو تحليل دورة الخلية القائم على قياس التدفق الخلوي لخلايا سرطان الرئة المنقولة باستخدام miRNA ، لدراسة تأثير miRNA على تنظيم دورة الخلية. أظهر تثبيط التكاثر عن طريق وقف تقدم دورة الخلية أنه من المحتمل أن يكون نهجا واعدا لعلاج السرطان.

البروتوكول

1. تعداء miR-143 و miR-506

تنبيه: استخدم قفازات اللاتكس والنظارات الواقية ومعطف المختبر أثناء إجراء التجارب الموصوفة. عند الحاجة ، استخدم خزانة السلامة الحيوية مع تشغيل مروحة الخزانة ، دون سد الشعب الهوائية أو إزعاج تدفق الهواء الرقائقي. اضبط النافذة الزجاجية الواقية دائما على الارتفاع المناسب ، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.

خلايا
1. البذور NSCLC A549 في T25 سم² قارورة / 6/96 صفيحة بئر في وسائط DMEM / F12K مكملة ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (وسط الاستزراع) في غطاء زراعة الأنسجة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في حاضنة زراعة الأنسجة.
2. قم بتعليق miR-143 و / أو miR-506 ، أو تقليد siRNA مع عامل التعدي (تم خلط 2.4 ميكروغرام من miR مع 14 ميكرولتر من عامل التعدي ؛ انظر جدول المواد) في 500 ميكرولتر من وسائط التعدي و 1.5 مل من وسائط المصل ووسائط DMEM / F12K الخالية من المضادات الحيوية بتركيز نهائي من miRNA يبلغ 100 نانومتر. قد تتطلب كمية miRNA التحسين على الخلايا والتركيزات المختلفة. تشمل الأساليب المناسبة تعدي الخلايا بتركيزات متزايدة من miRNA (أي 50-200 نانومتر) وتقييم تقليل تنظيم التعبير للجينات ذات الأهمية.
3. قم بإزالة وسائط الثقافة من القارورة / اللوحة واغسلها مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
4. أضف مجمعات عامل miRNA / التدافع واحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 6 ساعات (يحدد حجم القارورة حجم الحضانة المضاف).
5. استبدل الوسائط ب 4 مل من وسائط الاستزراع واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة و / أو 48 ساعة.
6. حصاد الخلايا المنقولة عن طريق التربسين ، عن طريق إضافة 1 مل من التربسين-EDTA في كل قارورة T25 سم² ، واحتضانها لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وإضافة 3 مل من وسائط الاستزراع لحصاد الخلايا. ضع محتويات كل قارورة في أنبوب منفصل سعة 15 مل. العمل في غطاء لزراعة الأنسجة.
7. جهاز طرد مركزي عند 751 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية
   ملاحظه: يجب توخي الحذر أثناء إزالة المادة الطافية ، لأن تحريك الأنبوب قد يتسبب في فقدان الخلايا.
8. أضف 2 مل من 1x PBS وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 751 × جم.
9. كرر الخطوتين 7 و 8 مرة واحدة لإزالة أي آثار للوسائط والمواد الطافية.
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين أنابيب العينة عند -80 درجة مئوية أو يمكن استخدامها على الفور.

2. تحليل دورة الخلية

1. قم بزرع 5 × 10⁵ خلايا لكل عينة في قارورة T25 سم² وقم بإجراء تعداء وفقا للبروتوكول الموضح في القسم 1 ، الخطوات 1-5.
2. بعد 24 ساعة و 48 ساعة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق التربسين.
3. انقل معلقات الخلية إلى أنابيب معقمة سعة 15 مل وقم بتسميتها بشكل صحيح.
4. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 751 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
5. أضف 2 مل من الثلج البارد 1x PBS ، والدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 751 × جم لمدة 5 دقائق.
6. كرر خطوة الغسيل مع 1x PBS لإزالة الوسائط المتبقية.
7. قم بتعليق الحبيبات وكسرها عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 1x PBS المثلج عن طريق سحب العينات.
8. قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من 70٪ من الإيثانول المثلج بالتنقيط إلى الأنبوب أثناء الدوامة برفق.
9. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في RT وضع الأنابيب عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
10. قم بإزالة الأنابيب من 4 درجات مئوية وأجهزة الطرد المركزي عند 751 × جم لمدة 5 دقائق.
11. أضف 2 مل من الثلج البارد 1x PBS ، والدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 751 × جم لمدة 5 دقائق.
12. أضف 500 ميكرولتر من 1x PBS مع يوديد البروبيديوم (50 ميكروغرام/مل) والريبونوكلياز A (200 ميكروغرام/مل).
13. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT مع حماية العينات من الضوء.
14. الحصول على بيانات عن مقياس التدفق الخلوي. استخدم التشتت الأمامي مقابل الجانب (FSC مقابل SSC) لتحديد المجموعة الرئيسية للخلايا ، باستثناء الحطام الموجود في الزاوية اليسرى السفلية من مخطط كثافة FSC مقابل SSC ومجموعات الخلايا في الجانب العلوي إلى الجانب العلوي الأيمن من مخطط كثافة FSC مقابل SSC.
15. تحليل البيانات لتحديد مجموعات الخلايا لكل مرحلة من مراحل دورة الخلية باستخدام البرامج المناسبة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM 4.5 جم / لتر جلوكوز ، مع بيروفات الصوديوم ، مع L/ Glutamine VWR VWRL0100-0500 مصل الأبقار الجنينية - بريميوم أنتلانتا بيولوجيكس S11150 مصل الأبقار الجنينية (FBS) فيشر ساينتيك 10438026 البنسلين الستربتومايسين 10/10 أنتلانتا بيولوجيكس ب 21210 ريبونوكلياز أ من البنكرياس البقري سيغما R6513-50 ملغ بروبيديوم يوديد إم بي بيوكيماويات ذ.م.م IC19545825 الإيثانول ، المطلق (200 برهان) ، درجة البيولوجيا الجزيئية فيشر الكواشف الحيوية BP2818500 حاضنة CO2 الترمو: العلمية HERAcell 150i A549 خلايا سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة ATCC ATCC CCL-185 96 لوحة بئر سيلتريت العلمية 50-607-511 FACS Calibur مقياس التدفق الخلوي بيكتون ديكنسون قوارير معالجة ثقافة خلايا Thermo Scientific BioLite الترمو: العلمية 12-556-009 ماتيشين الطرد المركزي الذي يتم التحكم فيه في درجة الحرارة الترمو: العلمية ST16R تسيطر على درجة الحرارة مايكرو الطرد المركزي المايشين إيبندروف 5415 ص أنابيب الطرد المركزي SpectraTube 15 مل VWR هاتف: 470224-998 مودفيت LT فيريتي البرمجيات الخطوة 2.15: برنامج بديل لتحليل توزيعات مجموعات دورة الخلية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة Fisherbrand Basix مع أغطية المفاجئة القياسية فيشربراند باسيكس 02-682-002 هاس-مير-143-3 ب miRNA مقلد ABM MCH01315 هاس-مير-506-3p miRNA مقلد ABM MCH02824 خليط المغذيات F-12K (Kaighn's Mod.) مع L-glutamine كورنينج كورنينج 45000-354 سالب 80 درجة مئوية فريزر VWR VWR40086A