$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تعداء miR-143 و miR-506
تنبيه: استخدم قفازات اللاتكس والنظارات الواقية ومعطف المختبر أثناء إجراء التجارب الموصوفة. عند الحاجة ، استخدم خزانة السلامة الحيوية مع تشغيل مروحة الخزانة ، دون سد الشعب الهوائية أو إزعاج تدفق الهواء الرقائقي. اضبط النافذة الزجاجية الواقية دائما على الارتفاع المناسب ، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
خلايا - البذور NSCLC A549 في T25 سم2 قارورة / 6/96 صفيحة بئر في وسائط DMEM / F12K مكملة ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (وسط الاستزراع) في غطاء زراعة الأنسجة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة زراعة الأنسجة.
- قم بتعليق miR-143 و / أو miR-506 ، أو تقليد siRNA مع عامل التعدي (تم خلط 2.4 ميكروغرام من miR مع 14 ميكرولتر من عامل التعدي ؛ انظر جدول المواد) في 500 ميكرولتر من وسائط التعدي و 1.5 مل من وسائط المصل ووسائط DMEM / F12K الخالية من المضادات الحيوية بتركيز نهائي من miRNA يبلغ 100 نانومتر. قد تتطلب كمية miRNA التحسين على الخلايا والتركيزات المختلفة. تشمل الأساليب المناسبة تعدي الخلايا بتركيزات متزايدة من miRNA (أي 50-200 نانومتر) وتقييم تقليل تنظيم التعبير للجينات ذات الأهمية.
- قم بإزالة وسائط الثقافة من القارورة / اللوحة واغسلها مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
- أضف مجمعات عامل miRNA / التدافع واحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 6 ساعات (يحدد حجم القارورة حجم الحضانة المضاف).
- استبدل الوسائط ب 4 مل من وسائط الاستزراع واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة و / أو 48 ساعة.
< p class = "jove_title" >2. تعبير البروتين بواسطة المصفوفة الدقيقة لدورة خلية الجسم المضاد
- قم بالبذور 5 × 105 خلايا لكل عينة في قوارير T25 سم2 وقم بإجراء تعداء وفقا للبروتوكول الموضح في القسم 1 ، الخطوات 1-5.
- بعد 24 ساعة و 48 ساعة ، حصاد الخلايا عن طريق التربسين.
- انقل معلقات الخلية إلى أنابيب سعة 15 مل وقم بتسميتها وفقا لذلك.
- جهاز طرد مركزي عند 751 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
- أضف 2 مل من 1x PBS والدوامة وأجهزة الطرد المركزي المثلجة عند 751 × جم لمدة 5 دقائق.
- كرر خطوة الغسيل مع 1x PBS.
- أضف 150 ميكرولتر من محلول التحلل المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني. Pipet لأعلى ولأسفل برفق لتعطيل أغشية الخلايا.
- لمنع أي تداخل في المخزن المؤقت للتحلل ، قم بإجراء تبادل عازل لاستبدال المخزن المؤقت للتحلل بمخزن مؤقت لوضع العلامات ، باستخدام أعمدة تبادل المذيبات الخاصة بالشركة المصنعة.
- حدد كمية البروتين الكلي باستخدام مقايسة BCA.
- خذ 70 ميكروغرام من عينة البروتين وأضف المخزن المؤقت لوضع العلامات لتحقيق حجم نهائي يبلغ 75 ميكرولتر.
- أضف 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) إلى 1 مجم من كاشف البيوتين (البيوتين / DMF).
- أضف 3 ميكرولتر من البيوتين / DMF إلى كل عينة بروتين (عينة بروتين بيوتينيل) واحتضن لمدة ساعتين في RT.
- أضف 35 ميكرولتر من الكاشف الموقف واخلطه عن طريق الدوامة.
- احتضان العينات في RT لمدة 30 دقيقة.
- قم بإزالة شرائح المصفوفة الدقيقة من الثلاجة حتى تسخن إلى RT لمدة ساعة واحدة قبل الاستخدام.
- قم بإجراء الحجب للربط غير المحدد عن طريق احتضان الشرائح بمحلول الحليب الجاف بنسبة 3٪ (في كاشف حجب مقدم من الشركة المصنعة) في طبق بتري مع رج مستمر لمدة 45 دقيقة في RT.
- اغسل الشرائح بماء ddH2O (ما لم ينص على خلاف ذلك ، يتم الغسيل باستخدام ddH2O).
- كرر خطوة الغسيل ~ 10x لإزالة محلول الحظر تماما من أسطح الانزلاق. هذا مهم لتحقيق خلفية موحدة ومنخفضة.
- قم بإزالة الماء الزائد من أسطح الشرائح وانتقل إلى الخطوة التالية دون ترك الشرائح تجف.
- تحضير محلول التوصيل عن طريق إذابة 3٪ من الحليب الجاف في كاشف اقتران.
- أضف 6 مل من محلول الاقتران وإلى الكمية الكاملة من عينة البروتين البيوتينيل المعدة مسبقا من الخطوة 12.
- ضع شريحة واحدة في بئر واحد من غرفة التوصيل التي يوفرها البائع وأضف ~ 6 مل من مزيج اقتران البروتين إليها.
ملاحظه: تأكد من أن الشريحة مغمورة بالكامل في محلول مزيج اقتران البروتين.
- قم بتغطية غرفة التوصيل واحتضانها لمدة 2 ساعة عند RT مع التحريك المستمر في شاكر مداري.
- انقل الشرائح إلى طبق بتري وأضف 30 مل من 1x المخزن المؤقت للغسيل. ضع طبق بتري في شاكر مداري ، ورجه لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المحلول.
- كرر الخطوة 24 2x.
- اشطف الشرائح بماء ddH2O على نطاق واسع كما هو موضح في الخطوتين 17 و 18 وانتقل إلى الخطوة التالية على الفور لتجنب الجفاف.
- أضف 30 ميكرولتر من Cy3-streptavidin (0.5 مجم / مل) في 30 مل من المخزن المؤقت للكشف.
- ضع الشريحة في طبق بتري وأضف 30 مل من المخزن المؤقت للكشف الذي يحتوي على Cy3-streptavidin.
- احتضن في شاكر مداري لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز مستمر محمي من الضوء.
ملاحظه: Cy-3 هي صبغة فلورسنت. قم بتغطيتها بورق الألمنيوم أو تعمل في ظل ظروف مظلمة للحفاظ على شدة التألق.
- قم بتنفيذ الخطوات من 24 إلى 26 واترك الشريحة تجف باستخدام تيار لطيف من الهواء أو ضع الشريحة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 1300 × جم لمدة 5-10 دقائق.
- ضع الشريحة في حامل الشريحة وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم.
- امسح الشريحة ضوئيا في ماسح ضوئي للمصفوفة الدقيقة باستخدام الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاث. في حالة Cy3 ، تكون ذروة الطول الموجي للإثارة عند ~ 550 نانومتر وذروة الانبعاث عند ~ 570 نانومتر.
- تحليل البيانات (راجع جدول المواد للبرامج المستخدمة).