تحضير رئة الفأر لقياس التدفق الخلوي: توليد تعليق الخلية من أنسجة الرئة لتحليل قياس التدفق الخلوي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Moll ، H. P. ، et al. زرع تقويم العظام لخلايا سرطان الرئة الغدي المتزاوي لدراسة تعبير PD-L1. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تحضير تعليق خلايا الرئة الفأرية لتحليل قياس التدفق الخلوي لدراسة تعبير PD-L1 لخلايا سرطان الرئة الغدي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الرئة لقياس التدفق

الخلوي

1. في نقطة النهاية التجريبية المرغوبة ، تخدير الفأر عن طريق الحقن تحت الجلد لخليط من الكيتامين (100 مجم / كجم من وزن الجسم) والزيلازين (10 مجم / كجم من وزن الجسم) والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
2. انقع الذبيحة في 70٪ من الإيثانول وقم بتأمين الماوس على لوحة تشريح باستخدام شريط لاصق.
3. قم بعمل شق بطني في خط الوسط واقلب الجلد برفق لكشف عضلات جدار الصدر وأعضاء البطن. ثقب الحجاب الحاجز وقطع الأضلاع بالمقص لفضح التجويف الصدري.
4. قم بنقخ الرئتين 3x مع 6-8 مل من PBS المثلج من خلال البطين الأيمن باستخدام إبرة 27 جم بعد قطع فتحة صغيرة في البطين الأيسر للسماح للدم بالمغادرة. يجب تطهير الرئتين من الدم وتتحول إلى اللون الأبيض تماما.
5. أخرج الرئتين وافرم الفصوص إلى قطع صغيرة باستخدام المقص. انقل قطع الرئة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل واحتضانه في 1.5 مل من المخزن المؤقت لهضم الرئة (RPMI ، 5٪ FCS ، 150 U / mL كولاجيناز I ، و 50 U / mL DNase I).
6. احتضان قطع الرئة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ومع الاهتزاز المستمر.
7. انقل تعليق الخلايا الرئوية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 50 مل. امسح المصفاة بالجزء الخلفي من حقنة معقمة سعة 10 مل واشطف المصفاة ب 15 مل من PBS مع 2٪ FCS.
8. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول التحلل الأمونيوم وكلوريد البوتاسيوم (ACK) واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحلل كريات الدم الحمراء المتبقية.
قم
9. بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من PBS مع 2٪ FCS واستمر في بروتوكول التلوين المطلوب لقياس التدفق الخلوي
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن إعادة تعليق الخلايا في RPMI التي تحتوي على 30٪ FCS و 10٪ DMSO وتجميدها باستخدام حاوية تجميد لتحليلها لاحقا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خط خلايا سرطان غدي في الرئة للفأر معزولة في المنزل C57Bl / 6 فئران يمكن استخدام F1 من صليب الخلفيتين (8-12 أسبوعا) 129S الفئران RPMI 1640 متوسط تقنيات الحياة 11544446 مصل ربلة الساق الجنينية تقنيات الحياة 11573397 محلول البنسلين / الستربتومايسين تقنيات الحياة 11548876 ل-جلوتامين تقنيات الحياة 11539876 كيتاسول (100 مجم / مل كيتامين) أوجريس فارما 8-00173 زيلازول (20 ملغم/مل زيلازين) أوجريس فارما 8-00178 ملقط حاد روبوز RS8260 مقص الطالب قزحية العين أدوات العلوم الدقيقة 91460-11 DNase I (خال من RNase) نيو إنجلاند بيولابيس M0303S الكولاجيناز النوع الأول تقنيات الحياة 17100017 ACK Lysing Buffer لونزا 10-548 ه