مقايسة التألق المناعي: طريقة لتحديد الخلايا السرطانية الملتقطة على سلك طبي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Gallerani، G. et.al. ، توصيف الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط الخلايا السرطانية المنتشرة: نهج ثلاثي الأبعاد يعتمد على التألق المناعي وأسماك الحمض النووي. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو تقنية تلطيخ التألق المناعي للخلايا السرطانية المنتشرة التي تم التقاطها على سلك طبي وظيفي. يسمح السلك الوظيفي بعزل CTCs في الجسم الحي ، مباشرة من مجرى دم المريض.

البروتوكول

فئة

1. أسماك الحمض النووي المناعي على الأسلاك

1. خط الخلية سبايك في على الأسلاك (دعم 3D)
   ملاحظه: يتضمن الإعداد الأولي اختيارا دقيقا لخطوط الخلايا الملتصقة بناء على إيجابية EpCAM. يتم تشغيل السلك بالأجسام المضادة ل EpCAM بحيث يتم تلطيخ الخلايا الإيجابية ل EpCAM فقط.
   ملاحظه: لا تلمس الجزء الوظيفي من السلك لتجنب أي ضرر.
   ملاحظه: يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء التدفق الصفحي في ظروف معقمة.
   1. أعد تعليق محتويات قارورة T75 بالكامل (التقاء 80٪) في قارورة سعة 5 مل باستخدام 4 مل من الوسط الكامل ؛ للحصول على ارتفاع واحد ، يوصى باستخدام حوالي 2،000،000 خلية لزيادة التصاق الخلايا بالسلك.
   2. قم بإزالة السلك من عبوته الزجاجية.
   3. اغمس الجزء الذهبي الوظيفي من السلك في القارورة ، مما يضمن أن سدادة الأسلاك مناسبة لمقاومة الماء للقارورة. ختم بفيلم مختبر.
      ملاحظه: يوصى باستخدام أنبوب سعة 5 مل للسماح بالتطابق الصحيح بين سدادة السلك والقارورة.
   4. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT في دوار أنبوبي (زاوية 0-120).
   5. اشطف السلك ثلاث مرات في محلول 1× PBS باستخدام 3 قوارير نظيفة مختلفة.
2. التثبيت والنفاذية
   أنذر: الأسيتون مادة قابلة للاشتعال يمكن أن تهيج الجهاز التنفسي. استخدم فقط البلاستيك المقاوم للأسيتون أو العبوات الزجاجية (بدون PVC أو PVDF).
   ملاحظه: قم بتنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء الدخان الكيميائي.
   1. جفف السلك بالهواء.
   2. قم بإصلاح الخلايا عن طريق غمس السلك في محلول الأسيتون 100٪ لمدة 10 دقائق في RT. استخدم أنبوبا سعة 5 مل.
      ملاحظه: يجب ألا تتلامس سدادة السلك مع المثبت.
   3. جفف السلك بالهواء لمدة 5 دقائق عند RT.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يجب تخزين السلك عند -20 درجة مئوية. عند تعبئة السلك للتخزين طويل الأجل ، ضع سدادة السلك بجوار الطرف الوظيفي وأدخل السلك بعناية في أنبوب زجاج التخزين ، مع الحرص على عدم إتلاف الطرف الوظيفي. أغلق زجاج التخزين وقم بتخزينه (عموديا أو أفقيا) عند -20 درجة مئوية.
3. يوم التألق المناعي 1
   ملاحظه: تتضمن هذه المرحلة حضانة بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة).
   1. اغسل مرتين في محلول 1× PBS باستخدام أنبوب 5 مل.
   2. احتضان السلك في مخزن مؤقت لتخفيف الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام أنبوب 5 مل.
   3. تحضير 150 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة مع تخفيف الجسم المضاد الأولي أحادي النسيلة المترافق مع الفلوروكروم في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة ، كما هو محدد في ورقة البيانات. على سبيل المثال ، تم استخدام الجسم المضاد EpCAM-FITC مع تخفيف 1:20.
   4. استخدم طرف p200 لإجراء الحضانة ، على النحو التالي: أخرج السلك من سدادة السلك وأدخل السلك برفق من خلال الفتحة الأكبر للطرف. أدخل الطرف غير الوظيفي أولا واسحب السلك ببطء من خلال الفتحة الأصغر حتى يصبح الجزء الذهبي خارج الفتحة الأكبر مباشرة.
   5. قم بإسقاط 150 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة برفق (على سبيل المثال ، مضاد EpCAM_FITC ، 1:20 مخفف) في الحافة. لتجنب خطر تكوين الفقاعات ، قم بتدوير السلك برفق حتى يغرق الجزء الوظيفي تماما.
   6. أغلق فتحة الحافة. يمكن أن يساعد لف فيلم المختبر حول الحفرة.
   7. احتضان عموديا بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة) في الظلام عند 4 درجات مئوية.
4. التألق المناعي اليوم 2
   1. منع حضانة الأجسام المضادة عن طريق غسل السلك مرتين في 1× PBS.
   2. أعد إدخال السلك في سدادة السلك.
      ملاحظه: يخزن في 1X PBS عند 4 درجات مئوية في قارورة سعة 5 مل حتى يتم إجراء فحص FISH.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ايثانول كارلو إربا # 414605 توين 20 بيو راد # 1706531 PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) فصه # 09-9400-100 أسيتون سيجما ألدريتش # 534064-500 مل الأسمنت المطاطي رويال تالينس # 95306500 EpCAM-FITC (استنساخ: HEA-125) ميتيني # 130-080-301 RPMI 1640 جيبكو # 31870-025 XT ALK BA مجسات MetaSystems # D-6001-100-OG Detektor CANCER01 EpCAM جيلوبي نانوميديزين سلك وظيفي ZEISS المجهر الفلوري Axioskop زييس برنامج نيكون NIS-Elements BR 4.11.00 64 بت نيكون كاميرا رقمية نيكون DS-QiMc 12 بت نيكون DS-QiMc