$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. جمع عينات البلازما
- اجمع 10 مل من عينة الدم الكاملة في أنابيب التفريغ مع K2EDTA المطلي بالرش وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظه: لتقليل انحلال الدم ، افصل البلازما في غضون 2 ساعة. لا تخزن الدم الكامل في درجة حرارة منخفضة (أي 4 درجات مئوية) لتجنب الصدمة الحرارية وتحلل الخلايا التي تؤدي إلى إطلاق miRNA غير محدد.
- في غضون ساعة واحدة ، افصل البلازما بخطوة الطرد المركزي الأولى عند 1،258 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
- انقل المادة الطافية في البلازما إلى أنبوب سعة 15 مل ، وتجنب ملامسة الحلقة اللمفاوية بعناية.
- جهاز الطرد المركزي للبلازما مرة ثانية عند 1,258 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
- Aliquot 1 مل من البلازما إلى 1.5 مل من cryovials ، وتجنب جمع جزء البلازما في قاعدة الأنبوب.
- قم بتخزين جميع الحصص عند -80 درجة مئوية ، باستثناء واحدة لتقييم انحلال الدم. يجب إجراء التحليل الجزيئي في غضون 5 أسابيع.
فئة
2. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي في البلازما
- قم بإعداد محلول 1-ثيوجلسرين / تجانس (OMG) مع 20 ميكرولتر من 1-ثيوجلسرين لكل مل من محلول التجانس. نظرا لأن 1-ثيوغليسرين لزج، فقم بتسخين الماصة بعناية للقياس الدقيق. قم بتبريد محلول OMG على الثلج أو عند 2-10 درجة مئوية قبل استخدامه.
ملاحظه: حل العمل مستقر عند 2-10 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
- قم بتعليق DNase I المجفف بالتجميد عن طريق إضافة 275 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى القارورة واخلطها برفق (لا تقم بالدوامة). كأداة مساعدة بصرية ، أضف 5 ميكرولتر من الصبغة الزرقاء إلى DNase I المعاد تكوينه وقم بتوزيع المحلول في حصص ذات استخدام واحد في أنابيب خالية من النوكلياز. قم بتخزين DNase I المعاد تكوينه عند -30 درجة مئوية إلى -10 درجة مئوية.
- بدءا من 200 ميكرولتر من البلازما ، أضف 200 ميكرولتر من محلول OMG المبرد.
- دوامة 15-30 ثانية لضمان التجانس الكامل. في حالة حدوث رغوة ، اترك العينة تستقر على الجليد.
- أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل و 25 ميكرولتر من البروتيناز K إلى العينة المتجانسة والدوامة لمدة 20 ثانية.
- احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في خلاط حراري مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
- قم بتحميل خرطوشة لكل عينة على درج سطح الأداة وضع القابس في الموضع المناسب.
- انقل المحللة إلى الموضع المناسب في خرطوشة الجهاز.
- أضف 5 ميكرولتر من محلول DNase I إلى الموضع المناسب في الخرطوشة.
- أضف 60 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى قاعدة كل أنبوب شطف.
- حدد طريقة "RSC miRNA Tissue" وابدأ تشغيل التنقية الآلي. يمكن تخزين إجمالي عينات الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية.