التلوين الكيميائي المناعي: طريقة للحصول على المعلومات المكانية من أقسام الأنسجة الرقيقة

Abstract

المصدر: Baharom F. et al. ، الخلايا المتغصنة للرئة البشرية: التوزيع المكاني وتحديد النمط الظاهري في خزعات داخل القصبة الهوائية باستخدام الكيمياء المناعية وقياس التدفق الخلوي. J. Vis. Exp. (2017)

يصف هذا الفيديو تقنية التلوين الكيميائي المناعي لتحديد الخلايا المتغصنة من الخزعات داخل القصبة.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تقسيم GMA.

1. تحضير محلول الأمونيا 0.05٪ بالماء المقطر. ضع السكين الزجاجي والخزعة في الميكروتوم. قم بمحاذاة كتلة الخزعة بعناية مع الشفرة عن طريق ضبط حامل السكين وزاوية كتلة الخزعة بحيث تستقر الشفرة بشكل مسطح على سطح الكتلة.
2. قم بقص أقسام بسمك 2 ميكرومتر باستخدام الميكروتوم بسرعة قطع بطيئة واستخدم الملقط لنقل الأقسام وطفوها على ماء الأمونيا. قم بتعويم الأقسام لمدة 45-90 ثانية ، مما يسمح باسترجاع المستضد اللطيف وفتح القسم.
3. التقط الأقسام مع شريحة المجهر. تحقق من أنسجة الخزعة عن طريق تلطيخها بسرعة باللون الأزرق تولويدين.
4. جفف الشرائح على لوح ساخن مضبوطة على 50 درجة مئوية وقم بتطبيق 500 ميكرولتر من صبغة التولودين الزرقاء المفلترة على قسم باستخدام ماصة باستور بلاستيكية. قم بتسخين القسم الموجود على اللوحة الساخنة حتى تبدأ حلقة خضراء في الظهور عند حافة البقعة ، ثم اغسلها بالماء.
5. باستخدام المجهر الضوئي ، تحقق من أنسجة الخزعة. يجب أن تحتوي الأقسام المستخدمة في الكيمياء المناعية على مناطق جيدة من الصفيحة المخصوصة والظهارة غير التالفة ، مع أقل عدد ممكن من الغدد وأقل قدر ممكن من العضلات الملساء.
6. قم بقص الأقسام التي تحتوي على أنسجة جيدة والتقطها بشرائح مجهر مطلية ببولي L-lysine (مطلية ب PLL) للتلوين الكيميائي المناعي. قص قسمين على الأقل من كل خزعة لتحليلها. الشرائح الجافة لمدة 1 ساعة على الأقل. بعد التجفيف ، يمكن لف الأقسام بورق قصدير وتخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين ، أو يمكن تلطيخها على الفور.

< p class = "jove_title" >2. تلطيخ كيميائي مناعي للخزعات داخل القصبات الهوائية المضمنة في GMA

ملاحظة: أزيد الصوديوم سام. تحضير محلول أزيد الصوديوم 0.1٪ داخل غطاء الدخان وبعيدا عن الأحماض. ملامسة الأحماض تحرر الغازات السامة.

1. ارسم حول الأقسام باستخدام قلم ذو رأس ماسي ورتب الشرائح على رف تلطيخ.
2. إجراء إحصار بيروكسيداز. تحضير محلول كتلة بيروكسيداز 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين في محلول أزيد الصوديوم 0.1٪. ضع 1 مل من كتلة البيروكسيديز على الأقسام واحتضانها لمدة 30 دقيقة.
3. قم بإعداد محلول غسيل من محلول ملحي 0.05 M Tris مخزن (TBS) ، درجة الحموضة 7.6. اغسل الشرائح في TBS ، 3 × 5 دقائق.
4. قم بإعداد محلول كتلة BSA بنسبة 1٪ في DMEM. افعل ذلك مسبقا وبكميات كبيرة ، وقم بتجميدها لحين الحاجة. قم بتصريف الشرائح واحتضان الأقسام في محلول الكتلة لمدة 30 دقيقة لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد. إذا استمر حدوث ارتباط غير محدد ، فقم بتضمين خطوة حضانة لمدة 30 دقيقة مع كتلة مصل بنسبة 5٪ من نفس النوع مثل الجسم المضاد الثانوي.
تخفيف
5. الجسم المضاد الأولي (CD45 أو CD1a) في TBS إلى التركيز المطلوب (CD45 المخفف عند 1: 1,000; CD1a مخفف عند 1: 1،00) وتطبيقه على الشرائح. قم بتغطية الأقسام واحتضانها طوال الليل في RT.
6. اغسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. تمييع الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل (الموجه ضد الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الأولية ، في هذه الحالة الأرانب المضادة للفأر F (ab'₂)) في TBS إلى التركيز المطلوب (1: 300 تخفيف) وتطبيقه على الشرائح. احتضان لمدة 2 ساعة في RT.
7. تحضير مركب ستربتافيدين بيوتين بيروكسيداز قبل 30 دقيقة على الأقل من الاستخدام. تأكد من وجود ما يكفي لتغطية جميع الشرائح. اغسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. ضع المحلول على الشرائح واحتضنه لمدة 2 ساعة في RT.
8. اغسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. تحضير محلول ركيزة بيروكسيداز 3-أمينو-9-إيثيل كاربازول (AEC) (مصنوع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة). ضعه على الشرائح واحتضنه لمدة 20-30 دقيقة أو حتى تتطور شدة البقعة المطلوبة.
9. اشطف الشرائح بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق.
10. قم بتصريف الشرائح وقم بتغطية الأقسام بوسط تركيب مائي دائم. جفف الشرائح على حرارة 80 درجة مئوية في فرن التجفيف. اترك الشرائح لتبرد ، ثم قم بتثبيتها باستخدام DPX وضع غطاء.

Materials