< p class = "jove_title" >1. عزل Exosome
ملاحظة: تم عزل الإكسوسومات من عينات البلازما باستخدام مجموعة تجارية ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وبإضافة معالجة RNAse: (يجب تنفيذ جميع هذه الخطوات باستخدام معدات الحماية الشخصية والبيئية واتباع إجراءات قانونية محددة للتلاعب بالعينات البيولوجية).
- خذ 1 مل من البلازما من كل عينة ، مخزنة عند -80 درجة مئوية ، وضعها على الثلج.
- الطرد المركزي للعينة عند 2,000 × جم لمدة 20 دقيقة في RT ؛ هذا المقطع إلزامي لإزالة الخلايا والحطام.
- انقل المادة الطافية التي تحتوي على البلازما النظيفة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
- جهاز الطرد المركزي للأنبوب الجديد عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة في RT.
- انقل المادة الطافية التي تحتوي على البلازما النظيفة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
- أضف 100 نانوغرام / مل من الحمض النووي الريبي إلى المادة الطافية واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق من أجل تحلل الحمض النووي الريبي المتداول.
- انقل كل البلازما المعالجة إلى أنبوب جديد سعة 2 مل وأضف 0.5 حجم من 1x PBS.
- دوامة العينة من أجل خلط المحاليل.
- أضف 0.05 محضر من محلول Proteinase K (مرفق في المجموعة) إلى العينة.
- دوامة العينة ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- أضف 0.2 حجم من المخزن المؤقت لهطول الأمطار إلى العينة واخلط المحاليل عن طريق الانعكاس.
- احتضان العينة عند 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
- استنشق وتخلص من المادة الطافية. تحتوي الحبيبات على الإكسوسومات المعزولة.
- أضف المخزن المؤقت المحدد إلى حبيبات الإكسوسوم من أجل تعليق الإكسوسوم. يعتمد اختيار المخزن المؤقت على التحليل المخطط له ، في هذه الحالة:
- أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS لإجراء تحليل TEM.
- أضف 346.5 ميكرولتر من مخزن التحلل المحدد لاستخراج الحمض النووي الريبي (من مجموعة تجارية) (تنبيه: خطر كيميائي).
- أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل لاستخراج البروتين (Tris-HCl 50 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.6 - كلوريد الصوديوم 300 ملي مولار - تريتون X-100 0.5٪ - PMSF 1 ملي مولار - ليوبيبتين / أبروتينين 10 ميكروغرام / مل) من أجل إجراء تحليل النشاف الغربي. (تنبيه: المخاطر الكيميائية).
- قم بتخزين الإكسوزومات العالقة عند -20 درجة مئوية.
