أسماك الحمض النووي ثلاثية الأبعاد: تقنية لتحديد موقع جين معين على الكروموسوم

الملخص

المصدر: Gallerani، G. et.al. توصيف الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط الخلايا السرطانية المنتشرة: نهج ثلاثي الأبعاد يعتمد على التألق المناعي وأسماك الحمض النووي. (2017).

عزل وتوصيف الخلايا السرطانية المنتشرة (CTC) من دم مرضى السرطان هو نوع من الخزعة السائلة غير الغازية ويرتبط بالانتكاس وتطور المرض. يصف هذا الفيديو تقنية تهجين مضان الحمض النووي في الموقع (DNA FISH) على الخلايا السرطانية الملتقطة على سلك طبي ، لدراسة جين معين ذي أهمية.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" > 1. 3D الحمض النووي - الأسماك اليوم 2

< p class = "jove_content" > الحذر: يجب إيلاء اهتمام خاص لارتفاع درجة حرارة الأدوات والغرفة الرطبة.

1. قم بإعداد فرن التهجين وفرن الحرارة الجافة (~ 3 ساعات قبل بدء بروتوكول DNA-FISH). اضبطي فرن التهجين على 75 درجة مئوية ، واضبطي الفرن على حرارة 37 درجة مئوية ، وقم بتبريد محلول 0.4× SSC (الرقم الهيدروجيني = 7.0 ± 0.1) إلى 4 درجات مئوية
   ملاحظه: تعد حالة الأس الهيدروجيني لمخازن FISH أمرا بالغ الأهمية ويجب أن تكون 7.0 ± 0.1.
2. اغسل السلك 3 مرات في محلول SSC 0.4× مثلج مثلج.
   ملاحظه: احتفظ بالسلك في الظلام لتجنب التبييض الضوئي بالفلوروكروم أثناء الإجراءات التالية.
3. يجف لمدة 10 دقائق في الظلام تحت خزانة الدخان.
4. دوامة وتدوير المسبار لمدة 5 ثوان.
5. قم بإسقاط 10 ميكرولتر من المسبار في الأنابيب الدقيقة الزجاجية. قم بتغطيتها بغشاء مختبري.
6. قم بتدوير الأنابيب الدقيقة على النحو التالي: لف الأنبوب الدقيق في مادة ماصة جافة ، ووضع الورق في أنبوب سعة 50 مل ، ثم قم بتدويره لفترة وجيزة.
7. ضع السلك المجفف بحذر في الأنبوب الدقيق وأدخل سدادة السلك. ختم مع الأسمنت المطاطي.
   أنذر: تتضمن الخطوتان التاليتان ارتفاع درجات الحرارة. ارتد قفازات واقية.
8. ضع السلك في غرفة رطبة مظلمة في فرن التهجين لمدة 8 دقائق عند 75 درجة مئوية للحصول على تمسخ الحمض النووي بالكامل.
9. انقل الحجرة الرطبة إلى فرن حراري جاف عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

< ص الفئة = "jove_title" >2. 3D الحمض النووي - الأسماك اليوم 3

1. ضع جرة تلطيخ منزلقة بمحلول 0.4× SSC في حمام مائي واضبطها على 72 درجة مئوية.
2. تحقق من درجة حرارة محلول SSC 0.4× حتى تصل إلى 72 ± 1 درجة مئوية.
3. قم بإعداد كوبين زجاجيين ، أحدهما يحتوي على محلول 2× SSC + 0.05٪ Tween (الرقم الهيدروجيني = 7.0 ± 0.1) والثاني بالماء المقطر.
4. قم بإزالة الحجرة الرطبة من فرن الحرارة الجافة ، وقم بإزالة الأسمنت المطاطي بعناية من سدادة السلك باستخدام ملاقط ، وأخرج السلك.
   ملاحظه: اسحب الطرف غير المطلي للسلك بحذر من خلال IN-Stopper ، مع الحرص على عدم إتلاف الطرف الوظيفي.
5. اغمس السلك في محلول 0.4× SSC لمدة دقيقتين عند 72 درجة مئوية.
6. اغسل السلك في محلول 2× SSC + 0.05٪ Tween لمدة 30 ثانية في RT.
7. اغسل السلك بالماء المقطر في RT.
8. جفف السلك تحت غطاء الدخان لمدة 10 دقائق في الظلام.
9. قم بإعداد محلول مخزون DAPI بحجم 1.43 ميكرومتر في 2 مل من 1× PBS.
10. احتضان الطرف الوظيفي للسلك بمحلول DAPI في قارورة سعة 2 مل لمدة 1 ساعة في الظلام عند RT.
11. اشطف السلك مرتين في 1× PBS وجففه بالهواء.

< p class = "jove_title" >3. 3D المراقبة والتحليل المجهر

1. ضع السلك في حامل السلك. أدخل الطرف الوظيفي بعناية من خلال نقطة دخول الحامل الخاص ، حتى يتطابق الطرف مع نقطة التوصيل. احرص على عدم إتلاف الطرف الوظيفي (الشكل 1 أ).
2. ضع الحامل الخاص على مرحلة المجهر. اضبط تركيز المجهر باستخدام عدسة 20×. ركز أولا بشكل خشن على الدعم الخاص ثم اضبط بدقة على الخلايا التي تبدو ساطعة في قناة DAPI.

النتائج

الشكل 1: سلك وظيفي ، ترتيب تخطيطي لمجسات تفكيك ALK ، مخطط الأنماط المتوقعة لإعادة ترتيب ALK ، وحامل خاص.(أ) تسلط الصناديق الحمراء الضوء على الأجزاء الرئيسية الثلاثة للسلك: الطرف الوظيفي ، والسدادة السلكية ، والطرف غير الوظيفي. الطرف الوظيفي هو الجزء الأكثر حساسية في السلك ويجب عدم لمسه أثناء المناولة لتجنب انفصال الخلية أو تلفها. (ب) يرتبط كل من المج...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات توين 20 بيو راد # 1706531 Vysis 20X SSC (66 جم) شركة أبوت الجزيئية # 30-804850 مسحوق يتم تعليقه في الماء المقطر ، على النحو الموصى به الماء ميلي بور DAPI ، درجة FluoroPure إنفيتروجين # D21490 ZEISS المجهر الفلوري Axioskop زييس