الحفاظ على أنسجة البارافين المدمجة بالفورمالين (FFPE): طريقة لدراسة مورفولوجيا الأنسجة

الملخص

المصدر: Nagaraj A.S. ، et al. ، إنشاء وتحليل استخلاص شرائح الورم كشرط أساسي للاختبار التشخيصي. J. Vis. Exp. (2018)

يصف الفيديو التالي كيفية الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة مع تثبيت الفورمالين وتضمين البارافين.

البروتوكول

فئة

1. تثبيت ومعالجة شرائح الأنسجة

1. ارفع بعناية المرجع غير المزروع لمدة 0 ساعة أو الشريحة المستنبتة على ورق ترشيح مبلل في PBS.
   1. للقيام بذلك ، أضف 2-3 مل من PBS فوق ورق ترشيح يوضع في طبق 10 سم. ضع الشريحة فوق ورق الترشيح وارفع ورق الترشيح للخارج باستخدام ملقط.
   2. انقل ورق الترشيح إلى شريط منسجم ، وأضف قطرة من الهيماتوكسيلين المخفف (1: 1 في الماء منزوع الأيونات) أعلى شريحة الأنسجة لتحديد موضع الشريحة بشكل واضح أثناء خطوات المعالجة اللاحقة (الشكل 1 د).
   3. أغلق الكاسيت وانقله إلى محلول فورمالين محايد مخزن مؤقت بنسبة 4٪. ثبت الأنسجة طوال الليل عند 4 درجات مئوية
      ملاحظه: أثناء وضع الشريحة فوق ورق الترشيح ، تأكد من أن الجزء العلوي من الشريحة متجها لأعلى ؛ يعد ذلك ضروريا لاتباع القسم العلوي والأوسط والسفلي من الشريحة أثناء التقسيم والتحليل كما هو موضح في الخطوة 2.3.
2. في اليوم التالي ، انقل الكاسيت إلى 70٪ EtOH ، وتابع على الفور خطوة معالجة أنسجة تضمين البارافين.
3. قبل معالجة الأنسجة ، اغسل الأنسجة في 100٪ EtOH 2x لمدة 10 دقائق لكل منها. في هذه الحالة ، استخدم محطة ميكروويف لمعالجة الأنسجة. حدد البرنامج المستخدم لسمك الأنسجة 1 مم واتبع التعليمات الواردة في الدليل (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
   ملاحظه: عند استخدام آلات معالجة الأنسجة الأخرى ، استخدم البرنامج المناسب لعينات الأنسجة الرقيقة.
4. لتضمين البارافين ، افتح كاسيت الطباعة واستخدم مشرطا لرفع الشريحة بعناية من ورق الترشيح. تخلص من ورق الترشيح وانقل الشريحة إلى قالب يحتوي على البارافين السائل.
   1. اضغط على المنديل على الجزء السفلي من قالب التضمين ، على سبيل المثال بوزن مسطح ، لضمان التقسيم المتساوي. ضع الجزء السفلي من الشريط النوسي أعلى القالب ، وأضف البارافين السائل فوقه. دع القالب يبرد على طبق بارد لمدة 30 دقيقة ، وافصل القالب عن كتلة البارافين.
      ملاحظه: كبديل للتضمين الأفقي ، من الممكن تضمين شريحة الورم عموديا عن طريق وضع الشريحة في وضع رأسي. تسمح الأقسام الرأسية بسهولة بتحليل التدرجات في الجدوى أو التعبير عن العلامة الوظيفية في قسم واحد. يتطلب تحليل التدرج مع الشرائح المضمنة أفقيا تقسيم البارافين كما هو موضح في الخطوة 2.2.

2. معالجة وتحليل الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين (FFPE)

1. قم بإعداد أقسام رقيقة 4 ميكرومتر من كتل شرائح أنسجة FFPE باستخدام ميكروتوم. عند التقسيم ، اضبط زاوية الكتلة بحيث يكون سطح الكتلة موجها أفقيا فيما يتعلق بالشفرة ؛ هذا ضروري للحصول على أقسام متساوية في جميع أنحاء الأنسجة.
2. لتمكين التقاط تدرج قابلية للبقاء المحتمل الناجم عن الثقافة ، أو هجرة الخلايا عبر الشرائح ، أو التدرجات في تعبير المؤشرات الحيوية عبر الشرائح المستنبتة ، اجمع الأقسام من الطبقات العلوية والوسطى والسفلية لكل شريحة من شرائح الأنسجة على شرائح الكائن كما هو موضح أدناه.
3. اجمع أقسام الأنسجة المتسلسلة من شريحة الأنسجة المضمنة في البارافين أولا في الجزء العلوي من الشرائح الزجاجية. استمر في جمع أقسام طبقات الأنسجة العميقة إلى المنتصف متبوعا بالجزء السفلي من الشرائح الزجاجية (الشكل 1E).
   ملاحظه: لاستيعاب ثلاثة أقسام على شريحة زجاجية ، قم بقص فائض البارافين المحيط بشريحة الأنسجة المضمنة.
4. اترك الأقسام تجف طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، واستمر في تلطيخ H&E أو الكيمياء المناعية كما هو موضح أدناه.
   ملاحظه: يمكن أن يحدث فقدان المستجد عند تخزين أقسام FFPE في درجات حرارة عالية أو لفترات طويلة من الزمن. يوصى بتخزين أقسام البارافين في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، ويجب إجراء تحليلات IHC في غضون 6 أشهر بعد التقسيم.
   1. بالنسبة لتلوين H & E ، قم بإزالة البارافينات وترطيبها على النحو التالي: الزيلين 3x لمدة 5 دقائق ، و 100٪ EtOH 3x لمدة دقيقة واحدة ، و 96٪ EtOH 2x لمدة دقيقة واحدة ، و 70٪ EtOH 1 × 1 دقيقة ، والماء منزوع الأيونات 2x لمدة دقيقة واحدة.
   2. احتضان الأقسام في محلول الهيماتوكسيلين المصفى حديثا لمدة 10 دقائق ، واغسلها تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق. اغمس الأقسام في الكحول الحمضي (1٪ حمض الهيدروكلوريك في 70٪ EtOH) لمدة 2 مرات ، واغسلها تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق متبوعة بحضانة 0.5٪ يوزين لمدة دقيقتين.
   3. بعد خطوة اليوزين ، قم بتجفيف الأقسام عن طريق غمر الشرائح في محاليل الكحول والزيلين ، على النحو التالي: 96٪ EtOH 2x لمدة 15 ثانية ، 100٪ EtOH 3x لمدة 30 ثانية ، زيلين 3x لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، قم بتضمين الأقسام في وسيط تركيب قائم على الزيلين.

النتائج

الشكل 1: التمثيل التخطيطي لسير العمل لإنشاء وتحليل نباتات شرائح الفئران المشتقة من ورم NSCLC.(أ) تخطيطي يصف جمع وإعداد الرئتين الحاملتين للورم للتقطيع. يتم حصاد فصوص الرئة من الفأر ويتم تشريح أنسجة الورم بعيدا عن الأنسجة الطبيعية. يشير رأس السهم الأسود والنجمة إلى حوالي 4 مم و 1 مم من الأورام ، على التوالي. يشير رأس السهم الأبيض إلى أنسجة الرئة الملصقة على سطح حامل العينة. يشير السهم...

المواد