تطبيق الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد: طريقة لتحديد تأثير صوتنة على خلايا سرطان الدم البشرية

الملخص

المصدر: Trendowski، M. et al. التوليد والتحليل الكمي للموجات فوق الصوتية النبضية منخفضة التردد لتحديد الحساسية الصوتية للخلايا الورمية غير المعالجة والمعالجة. J. Vis. Exp. (2015).

يصف هذا الفيديو الضرر الانتقائي لخلايا ابيضاض الدم البشرية باستخدام الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد. يوضح هذا التطبيق للموجات فوق الصوتية منخفضة التردد في حالة ما قبل السريرية في المختبر أنه يمكن تحقيق تدمير الخلايا من أجل فحص ومقارنة آثار صوتنة على سرطان الدم والخلايا الطبيعية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلايا والوسط

1. تحضير الوسط باستخدام 240 مل من سيروم دوبيكو المعدل من Iscove (IMDM) و 50 مل من سيروم الأبقار الجنينية. لا تقم بإذابة مصل الأبقار الجنيني في حمام الماء الساخن ، لأن الزيادات السريعة في درجة الحرارة يمكن أن تؤدي إلى حل وسط في استقرار المصل. يمزج 240 ميكرولتر من الجنتاميسين 50 مجم / مل و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين 100x في قارورة استزراع قياسية ، وأضفها إلى الوسط. قم بتخزين الوسط عند 4 درجات مئوية.
2. بذور خلايا U937 عند ~ 4 × 10⁴ خلايا / مل في قارورة 25 سم² باستخدام الوسط المحضر. قم بتقييم الخلايا من حيث التركيز وقابليتها للحياة باستخدام عداد الخلايا TC20 واستبعاد الtrypan blue عن طريق وضع 15-20 ميكرولتر من الخلايا و 15-20 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب طرد مركزي دقيق وخلط المحتويات. قم بتعبئة 15-20 ميكرولتر من هذا الخليط في شريحة أخذ العينات TC20، وابدأ عمليات العد، عن طريق وضع الشريحة في عداد الخلايا TC20.
3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، وتحقق من صلاحية الخلية باستخدام استبعاد التريبان الأزرق وعداد الخلايا TC20. عندما تكون الخلايا بتركيز مناسب و / أو تمت معالجتها بأجهزة التحسس بالصوتيات لإطار زمني مناسب ، انقل 3 مل من الخلايا من قارورة المزرعة إلى قارورة زجاجية سعة 20 مل. في هذا البروتوكول ، قم بزراعة خلايا U937 لمدة 48 ساعة ، ثم عالج ب 0.5 أو 1 أو 5 ملي مولار MeβCD لمدة 30 دقيقة لاستنفاد نسبة الكوليسترول في الخلايا بشكل كاف قبل الصوتنة.

< ص الفئة = "jove_title" >2. صوتنة الخلية

1. نزيل الغاز منزوع الأيونات والماء المقطر باستخدام فراغ وقارورة بوشنر. انقل الماء إلى قرن الكوب ، واملأه إلى مستوى 15 مم فوق الجزء العلوي من القرن. تؤدي عملية الصوتنة إلى مزيد من التفريغ للمياه لمدة بضع دقائق ، ويمكن أن تؤدي إلى تناقضات على مدار التجربة إذا لم يتم تشغيل النظام قبل صوتنة العينة. لذلك ، قم بتشغيل النظام لمدة ~ 7 دقائق قبل صوتنة العينة.
2. قم بتوصيل قارورة التلألؤ التي تحتوي على الخلايا بجهاز الإمساك. بعد ذلك ، قم بتوصيل جهاز التثبيت بالجزء العلوي من قرن الكأس واضبطه على ارتفاع 15 مم من أعلى القرن (على سطح الماء باستخدام آلية الانزلاق).
3. عادة ما يتم صوتنة الخلايا باستخدام ثلاث نبضات مدتها ثانية واحدة من الموجات فوق الصوتية ، مع تباعد 1 ثانية بين كل من هذه النبضات. لهذا البروتوكول ، صوتنة الخلايا في سعة 33٪ و 50٪ باستخدام جرعات النبض المذكورة أعلاه.

< ص فئة = "jove_title" >3. تقييم الخلايا للضرر بعد الصوتنة

1. قم بتقييم الخلايا العالقة بحثا عن التلف والجدوى باستخدام التريبان الأزرق وعداد الخلايا TC20. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتحليل العينة باستخدام عداد Z2. لتحليل عداد Z2، ضع ماصة معلق خلية سعة 100 ميكرولتر في محلول ملحي متساوي التوتر سعة 20 مل (نسبة 200: 1). قبل التحليل ، اغسل فتحة محلل الجسيمات Z2 مرتين على الأقل باستخدام محلول ملحي متساوي التوتر. ضع عينة Z2 في حامل العداد، وارفع المنصة إلى فتحة العدسة قبل بدء العد.
2. احصل على البيانات من عدادات TC20 و Z2 باستخدام البرامج التي توفرها الشركة المصنعة. تحليل هذه البيانات لتلف الخلايا وقابليتها للحياة وإنشاء الحطام الخلوي من الصوتنة.

المواد