< p class = "jove_title" >1. اختبار XTT لتحديد صلاحية الخلية ونشاط الميتوكوندريا لخلايا U937 و THP1 المعالجة
- قبل فحوصات XTT ، قم بزراعة خلايا U937 و THP1 في نفس الظروف. المعالجة المسبقة للخلايا بنفس نطاق تركيز MeβCD لمدة 30 دقيقة قبل الصوتنة. استخدم نفس معلمات الموجات فوق الصوتية كما كان من قبل باستثناء أن الخلايا يتم صوتنة الآن باستخدام مجموعة من 1-3 نبضات ثانية واحدة متباعدة ثانية واحدة لتطوير مجموعة من الضرر لمجموعة XTT لتقييمها.
ملاحظه: يتم اتخاذ العديد من هذه الخطوات مباشرة من دليل مجموعة XTT ويتم تكرارها فقط لراحة المختبرات المهتمة.
- اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الخلايا عند ~ 1 × 105 خلايا / مل ، قم بزرع خلايا U937 عند 100 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة ميكروتيتر مسطحة القاع 96 بئرا في ثلاث نسخ ، ثم كرر ذلك لخلايا THP1 باستخدام صفيحة منفصلة مكونة من 96 بئرا. قم بتضمين 3 آبار تحكم تحتوي على 100 ميكرولتر من وسط النمو الكامل وحده كقراءات امتصاص فارغة. ثم احتضان الألواح الملقحة لمدة 24 ساعة.
- قم بإذابة حصتين من كاشف XTT وكاشف التنشيط عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. حرك الأجزاء برفق حتى يتم الحصول على محاليل واضحة. أضف 0.1 مل من كاشف التنشيط إلى 5.0 مل من كاشف XTT ، والذي يشكل ما يكفي من محلول XTT المنشط لمقايسة لوحة ميكروتيتر 96 بئر. كرر العملية مع اللوحة الأخرى.
- أضف 50 ميكرولتر من محلول XTT المنشط إلى كل بئر. أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلية CO2 لمدة 2 ساعة. رج الطبق برفق بعد فترة الحضانة لتوزيع اللون البرتقالي بالتساوي في الآبار الإيجابية. قم بقياس امتصاص آبار الفحص التي تحتوي على الخلايا وآبار التحكم في الخلفية الفارغة بطول موجي يتراوح بين 450-500 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ميكروتيتر.
- إما أن تصفر قارئ لوحة الميكروتيتر باستخدام آبار التحكم الفارغة أو تطرح متوسط قيمتها من النتائج المحددة. قم بقياس امتصاص جميع آبار الفحص مرة أخرى بطول موجي يتراوح بين 630-690 نانومتر واطرح القيم من قيم 450-500 نانومتر التي تم الحصول عليها. ملاحظة: يساعد تحديد الامتصاص الثاني هذا على التخلص من القراءات غير المحددة من نتائج الفحص. تكرر اختبار XTT أربع مرات لكلا خطي الخلايا.
