مقايسة وضع العلامات على نبض برومودوكسيوريدين: تقنية لقياس تكاثر الخلايا

الملخص

المصدر: Welschinger R. et al. التتبع الزمني لتقدم دورة الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي دون الحاجة إلى التزامن. J. Vis. Exp. (2015)

يصف الفيديو مقايسة وضع العلامات النبضية التدريجية لخلايا الثدييات باستخدام برومودوكسيوريدين (BrdU) لقياس تكاثر الخلايا. يسمح امتصاص BrdU بالتتبع الزمني للخلايا التي كانت في مرحلة التوليف في وقت محدد ، دون الحاجة إلى مزامنة الخلايا.

البروتوكول

1. الحلول والكواشف

1. RPMI كامل
   1. أضف 56 مل من مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) و 5.5 مل من 200 ملي من L-glutamine إلى زجاجة 500 مل من RPMI-1640 متوسط.
2. حل مخزون BrdU
   1. تحضير 32.5 ملي مولار BrdU (10 مجم / مل) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco.
3. BrdU كامل RPMI
   1. أضف 6.2 ميكرولتر من محلول مخزون BrdU إلى 10 مل من RPMI الكامل.
4. حل DNase
   1. تحضير 1 مجم DNase / مل في DPBS.
5. تلطيخ العازلة
   1. تحضير 3٪ FCS معطل بالحرارة و 0.09٪ أزيد الصوديوم في DPBS.
6. ارجع إلى قائمة المواد للحصول على تعريفات المخزن المؤقت للتثبيت ومخزن النفاذية ومخزن الغسيل.

< p class = "jove_title" >2. الخلايا

ملاحظة: لم يتم زراعة الخلايا لأكثر من 6 أشهر. هذه الطريقة قابلة للتكيف بشكل مباشر مع أي خط خلية غير ملتصق مع تعديلات على كثافة الخلايا ووسائط الاستزراع. استخدم الخلايا التي تنمو بشكل كبير عند بدء التجربة.

1. الحفاظ على خلايا NALM6 في قوارير ثقافة T-75 في RPMI الكامل. قم بتنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة باستخدام خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية.
2. حافظ على خلايا NALM6 بين 1-2 × 10⁶ خلايا لكل مل عن طريق تقسيم المزرعة ثلاث مرات أسبوعيا.
3. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في الهواء.

< p class = "jove_title" >3. وضع العلامات النبضية للخلايا باستخدام BrdU

تنبيه: تعامل مع BrdU بحذر لأنه مطفر ومطيخ محتمل.

1. خلايا الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق < / > ملاحظه: يؤدي نقل الخلايا إلى وسائط جديدة إلى تحسين قابلية تكرار النتائج.
2. قم بإجراء تعداد الخلايا وإعادة تعليق الخلايا في RPMI الكامل بمعدل 2 × 10⁶ خلايا / مل.
3. تمييع الخلايا 1 في 2 مع BrdU Complete RPMI ينتج تركيزا نهائيا للخلية يبلغ 1 × 10⁶ خلايا / مل.
4. احتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 45 دقيقة ، ثم قم بتخفيف الخلايا 1 في 10 باستخدام RPMI كامل. خلايا الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص بعناية من كل المادة الطافية
5. قم بتعليق الخلايا بحجم صغير (~ 100 ميكرولتر) من RPMI الكامل ، وقم بإجراء عدد الخلايا واضبطه على 1 × 10⁶ خلايا / مل.
6. ماصة 1 مل من الخلايا في آبار صفيحة 48 بئر. ماصة 1 مل من DPBS في أي آبار غير مأهولة للحصول على نتائج أكثر قابلية للتكرار.
7. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في الهواء للنقاط الزمنية المرغوبة ، هنا 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 10 و 11 و 12 و 13 و 14 و 15 و 16 و 17 و 18 و 19 و 20 و 21 و 22 و 23 و 24 ساعة
   ملاحظه: سيعتمد طول الوقت على ما يهدف التصميم التجريبي إلى قياسه.
8. انقل جميع الخلايا إلى أنابيب FACS باستخدام ماصة. اشطف البئر بالتتابع بكميات 1 مل من PBS إلى الحجم الإجمالي النهائي 5 مل.
9. جهاز طرد مركزي بمعدل 150 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة كل المادة الطافية بعناية. الخلايا جاهزة للتلوين ، قم بذلك (القسم 4) على الفور.

< p class = "jove_title" >4. تلطيخ الخلية

ملاحظة: إذا كان تلطيخ سطح الخلايا مطلوبا ، فقم بإجراء ذلك قبل التثبيت ، مع التأكد من الاحتفاظ بالخلايا عند 4 درجات مئوية طوال الوقت.

1. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين (لتلوين السطح الاختياري ، أضف الحجم الموصى به من الجسم المضاد إلى المستضدات السطحية واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية).
2. أضف 1 مل من محلول التلوين ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 150 × جم وتخلص من المادة الطافية.
   ملاحظة: سيختلف الجسم المضاد المحدد والتركيز ووقت الحضانة وما إلى ذلك اعتمادا على الأهداف التجريبية المحددة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات NALM6 DSMZ لجنة التنسيق الإدارية 128 5-برومو-2 ′-ديوكسيوريدين سيغما B5002-1G RPMI 1,640 مع L-Gln 500 مل لونزا 12-167 فهرنهايت DPBS لونزا 17-512 فهرنهايت مصل الأبقار الجنينية فيشر بيوتيك FBS-7100113 حاضنة CO2 الموثق ج 150 أنابيب BD Falcon 12 × 75 مم FACS BD Biosciences 352008 مقياس التدفق الخلوي BD LSR FORTESSA BD Biosciences فورتيسا الطرد المركزي سبينترون جي تي -175 آر