مقالة منهجية

تلطيخ التألق المناعي BrdU: تقنية لتحديد الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Welschinger، R.، et al. التتبع الزمني لتقدم دورة الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي دون الحاجة إلى التزامن. J. Vis. Exp. (2015).

يصف هذا الفيديو بروتوكول تلطيخ التألق المناعي BrdU. تسمح هذه التقنية بتحديد الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية. تسمح إضافة أصباغ الحمض النووي ووضع العلامات على الأجسام المضادة بالتحليل التفصيلي لمصير خلايا الطور S في أوقات لاحقة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الحلول والكواشف

  1. RPMI كامل
    1. أضف 56 مل من مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) و 5.5 مل من 200 ملي من L-glutamine إلى زجاجة 500 مل من RPMI-1640 متوسط.
  2. حل DNase
    1. تحضير 1 مجم DNase / مل في DPBS.
  3. تلطيخ العازلة
    1. تحضير 3٪ FCS معطل بالحرارة و 0.09٪ أزيد الصوديوم في DPBS.
  4. ارجع إلى قائمة المواد للحصول على تعريفات المخزن المؤقت للتثبيت ومخزن النفاذية ومخزن الغسيل.
< ص الفئة = "jove_title" >2. تلطيخ الخلية

ملاحظة: إذا كان تلطيخ سطح الخلايا مطلوبا ، فقم بإجراء ذلك قبل التثبيت ، مع التأكد من الاحتفاظ بالخلايا عند 4 درجات مئوية طوال الوقت.

  1. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين (لتلوين السطح الاختياري ، أضف الحجم الموصى به من الجسم المضاد إلى المستضدات السطحية واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية).
  2. أضف 1 مل من محلول التلوين ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 150 × جم وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظه: سيختلف الجسم المضاد المحدد والتركيز ووقت الحضانة وما إلى ذلك اعتمادا على الأهداف التجريبية المحددة.
  3. التثبيت والنفاذية
    1. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. أضف 1 مل من محلول الغسيل ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 150 × جم وتخلص من المادة الطافية.
    3. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق على الجليد.
    4. أضف 1 مل من محلول الغسيل ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 150 × جم ، وتخلص من المادة الطافية.
    5. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت لكل أنبوب واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. أضف 1 مل من محلول الغسيل ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 150 × جم ، وتخلص من المادة الطافية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا إذا لزم الأمر. تكون الخلايا الثابتة مستقرة لعدة أيام عند 4 درجات مئوية إذا تم تعليقها في مخزن مؤقت للتلطيخ. قم بإزالة المخزن المؤقت للتلطيخ بعد الطرد المركزي قبل المتابعة.
  4. علاج DNase
    1. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول DNase (30 ميكروغرام من DNase / 106 خلايا) واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    2. أضف 1 مل من محلول الغسيل ، وجهاز الطرد المركزي بوزن 150 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  5. تلطيخ الأجسام المضادة
    ملاحظة: يمكن إجراء تلطيخ العلامات داخل الخلايا بخلاف BrdU في وقت واحد مع تلطيخ BrdU.
    1. هام: قم بإعداد ضوابط التعويض التي تتكون من خلايا وخلايا غير ملوثة بعلامة كل فلوروكروم واحد. من الناحية المثالية ، استخدم نفس الأجسام المضادة لضوابط التعويض مثل تلك المستخدمة في الأنابيب التجريبية. ومع ذلك ، إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فاستبدل الأجسام المضادة بمستضدات عالية التعبير مترافقة مع نفس الفلوروكروم.
    2. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وأضف 1 ميكرولتر / 106 خلايا من الجسم المضاد BrdU.
      ملاحظة: يمكن أيضا إضافة الأجسام المضادة المترافقة مباشرة إلى مستضدات أخرى محددة داخل الخلايا.
      ملاحظه: يمكن استخدام الأجسام المضادة لهيستون H3 المفسفرة على Ser10 للتمييز بين الخلايا في G2 و M ، ويتم فسفرة هيستون H3 على Ser10 أثناء الانقسام. يمكن استخدام الأجسام المضادة ل cdc2 الفسفرة على Tyr15 للكشف عن الخلايا التي التزمت بالانقسام.
    3. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. أضف 1 مل من محلول الغسيل ، وخلايا الطرد المركزي بوزن 150 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
    قيمة
  1. صبغة الحمض النووي لتحليل دورة الخلية
    1. قم بفك الحبيبات وإضافة 20 ميكرولتر من محلول 7-AAD (0.25 ميكروغرام).
      ملاحظة: من الأهمية بمكان استخدام كمية ثابتة من 7-AAD / خلية.
    2. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات APC BrdU تدفق كيت BD Biosciences 552598 يحتوي على الجسم المضاد BrdU و 7-AAD و BD Cytofix / Cytoperm Buffer (يشار إليه باسم Fixation Buffer) BD بيرم / الغسيل العازلة BD Biosciences 554723 يشار إليه باسم مخزن الغسيل المؤقت BD Pharmingen Stain Buffer BD Biosciences 554656 بيبيتمان جيلسون P2 ، P20 ، P100 ، P1000 DNase سيغما د-4513 BD Cytoperm نفاذية العازلة Plus BD Biosciences 561651 يشار إليه باسم المخزن المؤقت للنفاذية الطرد المركزي سبينترون جي تي -175 آر AF488 الأجسام المضادة للهيستون H3 فوسفو (Ser10) إشارات الخلية 9708 ثانية Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) أرنب mAb إشارات الخلية 2197 ثانية Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) أرنب mAb إشارات الخلية 2348 ثانية أنابيب BD Falcon 12 × 75 مم FACS BD Biosciences 352008

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

S NALM 6 7 AAD

مقالات ذات صلة