أخذ عينات الدم المدارية الرجعية: طريقة لعزل الخلايا أحادية النواة من الجيوب الأنفية المدارية الرجعية للفأر

الملخص

المصدر: Mopin A. et al. بروتوكول مفصل لتوصيف خط خلية الفئران C1498 ونموذج فأر سرطان الدم المرتبط به. J. Vis. Exp. (2016)

يصف الفيديو طريقة أخذ العينات لجمع الدم المحيطي من الجيوب الأنفية المدارية الرجعية للفأر ومزيد من العزل للخلايا أحادية النواة من الدم مع الطرد المركزي المتدرج الكثافة.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. جمع الدم المداري الرجعي

1. قم بإجراء جمع الدم المداري الرجعي قبل القتل الرحيم مباشرة في ظروف معقمة في غطاء التدفق الصفحي وتحت مصباح التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم.
2. للتخدير ، استخدم الكيتامين بمعدل 150 مجم / كجم والزيلازين بمعدل 10 مجم / كجم. تحضير محلول التخدير عن طريق تخفيف 1.5 مل من الكيتامين و 0.5 مل من الزيلازين في 18 مل من محلول PBS.
3. أدخل أنبوبا شعريا في القناة الإنسية للعين. يرتفع الدم من الجيب الحجاجي إلى الأنبوب الشعري. السيطرة على النزيف عن طريق الضغط برفق على العين باستخدام إسفنجة شاش معقمة.
   ملاحظه: يمكن جمع حجم من 100 إلى 200 ميكرولتر من الدم باستخدام هذه التقنية.
4. اجمع الدم في أنبوب EDTA ، وقم بتخزين العينة على الجليد قبل عزل الخلايا أحادية النواة.

< p class = "jove_title" >2. عزل خلايا الدم أحادية النواة

1. انقل عينة الدم (100 إلى 200 ميكرولتر ؛ تم الحصول عليها من الخطوة 1.1) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، وأضف محلول PBS / 1 mM EDTA حتى يصبح حجم المحلول 500 ميكرولتر. لا تخلط الدم مع محلول الفصل.
2. الطرد المركزي الأنابيب عند 800 × جم (بدون فرامل) لمدة 20 دقيقة في RT. بعد الطرد المركزي ، اجمع الحلقة الخلوية (الطبقة البيضاء غير الشفافة) باستخدام ماصة. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
   ملاحظه: تحتوي الطبقة البيضاء غير الشفافة على الخلايا الليمفاوية وكذلك الخلايا الوحيدة وتظهر بين الطبقة السفلية - المحلول الفاصل - والطبقة العليا.
3. أضف 1 مل من محلول PBS ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 350 × جم لمدة 10 دقائق.

المواد