مقالة منهجية

تلطيخ May-Grunwald Giemsa: طريقة لتلطيخ خلايا نخاع العظام

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Mopin، A. et al. بروتوكول مفصل لتوصيف خط خلية الفئران C1498 ونموذج فأر سرطان الدم المرتبط به. J. Vis. Exp. (2016).

يصف هذا الفيديو تقنية تلطيخ خلايا نخاع العظم باستخدام May- Grünwald Giemsa Staining. في البروتوكول ، سنقوم بتلطيخ خلايا ابيضاض الدم النخاعي الفئراني ، خلايا C149 ، لتحليل التشكل والعد التفاضلي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. توصيف في المختبر لخط الخلية C1498

  1. الثقافة المختبرية لخلايا C1498
    1. تحضير RPMI كامل (معهد روزويل بارك التذكاري) 1640 وسط بإضافة 50 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 5 مل من البنسلين (100 وحدة / مل) - ستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، و 500 ميكرولتر من 50 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول ، و 5 مل من حمض السلفونيك N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane (HEPES) ، و 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية و 5 مل من بيروفات الصوديوم إلى 500 مل من وسط RPMI.
    2. قم بتنمية خط الخلايا C1498 في RPMI الكامل. احصد الخلايا المعلقة عن طريق سحب العينات ، وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 10 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية.
    3. أضف 20 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1x) ، وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 10 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية.
    4. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت لفارز الخلايا المنشط بالفلورة (FACs) (2.5 جم من مسحوق ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 2 مل من محلول حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) 0.5 M في 500 مل من محلول PBS). عد الخلايا باستخدام غرفة عد خلايا توما بعد تلطيخ الخلايا باللون الأزرق الترباني.
< p class = "jove_title" >2. تحضير تعليق الخلية على الشرائح للفحص المجهري

  1. اغسل 106 من خلايا C1498 المحصودة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.1.4) ب 5 مل من المخزن المؤقت البارد ل FACs مرتين ، وقم بتخفيف الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت البارد ل FACs. ضع الأنابيب على الجليد.
  2. ضع الشرائح في غرف يمكن التخلص منها باستخدام بطاقات الترشيح المرفقة مسبقا وضعها في جهاز طرد مركزي للخلايا.
  3. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACs إلى كل غرفة وبطاقة مرشح ، وقم بتدويرها لمدة دقيقتين عند 4.52 × جم.
  4. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل حجرة وبطاقة تصفية ، وقم بتدوير الخلايا عند 4.52 × جم لمدة دقيقتين.
  5. قم بإزالة الشرائح بعناية من الغرف وجفف الشرائح بالهواء قبل تلطيخها بصبغة May-Grünwald Giemsa.
< p class = "jove_title" >3. تلطيخ May-Grünwald Giemsa (MGG)

    قم
  1. بتلطيخ الخلايا (المحضرة في القسم 2) عن طريق غمر الشرائح في وعاء كوبلين يحتوي على محلول May-Grünwald لمدة 3 دقائق.
  2. انقل الشرائح إلى وعاء Coplin يحتوي على محلول عازلة بدرجة الحموضة 6.8 لمدة 1 دقيقة.
  3. قم بتلطيخ الشرائح عن طريق وضعها في برطمان Coplin يحتوي على محلول Giemsa R (مخفف إلى 1/20 في محلول عازلة بدرجة حموضة 6.8) لمدة 10 دقائق. اغسل الشرائح بالماء المحايد (درجة الحموضة 7) لمدة 10 ثوان.
  4. صفي الشرائح وجففها بالهواء. قم بتركيب الشرائح عن طريق تطبيق قطرة واحدة من وسيط التثبيت 2 على الخلايا. ضع إحدى حواف زجاج الغطاء على الشريحة وقم بخفضها بحذر على الخلايا باستخدام الملقط. اضغط برفق على زجاج الغطاء لإزالة أي فقاعات هواء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خط خلية C1498 ATCC تي آي بي 49 2-ميركابتو إيثانول ، جيبكو ثيرموفيشر العلمي 21985 مصل الأبقار الجنينية (FBS) ثيرموفيشر العلمي 10270 هيبس ، جيبكو (1 م) ثيرموفيشر العلمي 15630 [م] البنسلين الستربتومايسين ، جيبكو ثيرموفيشر العلمي 15140 RPMI 1640 متوسط (Gibco ، مكمل GlutaMAX) ثيرموفيشر العلمي 61870 [م] محلول تريبان الأزرق (0.4٪) ثيرموفيشر العلمي 15250-061 التركيز 1/2 بطاقة الغرفة والفلتر (EZ Cytofunnel Shandon) الترمو: العلمية A78710003 حل May-Grünwald تشخيص RAL 320070 حل Giemsa R تشخيص RAL هاتف: 320310 التركيز 1/20 محلول عازلة لدرجة الحموضة 6.8 تشخيص RAL 330368 الشرائح (Starfrost - حواف الأرض 90) زجاج التنايك VS1137 # 077FKB نظارات غطاء مجهر، 24 × 24 مم زجاج التنايك VD1 2424 Y100 شاندون سيتوسبين 3 جهاز طرد خلوي ثيرموفيشر العلمي

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

6 8 R FACS

مقالات ذات صلة