الطرد المركزي المتدرج الكثافة: طريقة لعزل خلايا CLL من الدم المحيطي

الملخص

المصدر: Hay، J. et al. تجزئة تحت الخلايا لخلايا ابيضاض الدم الليمفاوية المزمنة الأولية لمراقبة الاتجار بالبروتين النووي / السيتوبلازمي. J. Vis. Exp. (2019).

< p class = "jove_content">يصف هذا الفيديو تقنية عزل خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن (CLL) من الدم المحيطي. باستخدام هذا البروتوكول ، سنقوم بعزل خلايا CLL من عينة دم المريض البشري من أجل التوليد الفعال اللاحق للأجزاء النووية والسيتوبلازمية.

البروتوكول

1. عزل خلايا CLL من عينات دم المريض

1. يتم تلقي عينات الدم المحيطية من مرضى CLL المعتمدين مسبقا من العيادة في أنابيب جمع الدم EDTA ، مصحوبة بعدد الخلايا البيضاء (WCC). تنقية عينات CLL للدم المحيطي وفقا لمجلس الكنائس العالمي. بالنسبة لمجلس الكنائس العالمي <⁴⁰ × 10 6 خلايا/مل، انتقل إلى الخطوة 1.1.1؛ بالنسبة لمجلس الكنائس العالمي ≥⁴⁰ × 10 6 خلايا/مل، انتقل إلى الخطوة 1.1.2.
   1. صب محتويات جميع أنابيب الدم EDTA في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل سعة 50 مل وأضف 50 ميكرولتر من كوكتيل تخصيب الخلايا البائية البشرية لكل 1 مل من الدم. احتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة. انتقل إلى الخطوة 1.1.2.
   2. خفف العينة بنسبة 1: 1 باستخدام محلول الغسيل RT CLL (محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، مصل بقري الجنين 0.5٪ (FBS) و 2 ملي مولار EDTA).
وسائط
2. تدرج الكثافة Aliquot RT في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل مناسب للعينة (10 مل في أنبوب 50 مل ل 30 مل من العينة أو 4 مل في أنبوب 15 مل ل 10 مل من العينة).
3. ضع العينة بعناية فوق وسائط تدرج الكثافة وجهاز الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة عند RT.
   ملاحظة: تأكد من أن جهاز الطرد المركزي في RT قبل وضع العينات في جهاز الطرد المركزي لأن التغيير في درجة الحرارة سيؤدي إلى ضعف تخصيب الخلايا أحادية النواة ، وإيقاف تشغيل الفرامل على جهاز الطرد المركزي ، حيث يمكن أن يؤدي الكبح المفاجئ إلى تعطيل واجهة السائل.
4. احصد برفق الطبقة البيضاء من الخلايا أحادية النواة التي تتجمع عند واجهة وسائط تدرج الكثافة والمخزن المؤقت للغسيل CLL ، في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 50 مل باستخدام ماصة باستور بلاستيكية.
5. أضف 40 مل من المخزن المؤقت للغسيل CLL إلى الطبقة الأحادية المعزولة لغسل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات عن طريق النقر على الجزء السفلي من الأنبوب ، ثم كرر خطوة الغسيل الموضحة في الخطوة 1.5.
7. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات كما هو موضح في الخطوة 1.6 ، ثم أعد تعليق الحبيبات في حجم محدد من المخزن المؤقت للغسيل CLL (حتى 40 مل ، اعتمادا على حجم حبيبات الخلية).
8. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق ومقياس الدم. ثم انتقل إلى قياس التدفق الخلوي للتحقق من نقاء خلايا CLL.
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن زراعة خلايا CLL بتركيز 10 × 10⁶ خلايا / مل في وسائط لاستخدامها في التجارب ، و / أو حفظها بالتبريد في 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) / FBS للعمل المستقبلي بتركيزات تصل إلى 100 × 10⁶ خلايا / قارورة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنبوب 15 مل جرينر بيو واحد 188271 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيق جرينر بيو واحد 616201 DMSO سيغما د2650 EDTA سيغما EDS مصل الأبقار الجنينية ثيرموفيشر 10500064 وسائط التدرج الكثافة Histopaque1077 سيغما H8889 تريبان بلو سوليشن ثيرموفيشر 15250061 أقراص PBS فيشر ساينتيك BR0014G كوكتيل تخصيب الخلايا البائية البشرية RosetteSep تقنيات الخلايا الجذعية 15064 سيجما 3-16 ف SciQuip الطرد المركزي