مقالة منهجية

تحضير الكسور تحت الخلوية من خلايا سرطان الدم: طريقة لتوليد الكسور الخلوية والنووية من خلايا سرطان الدم

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Hay، J.، et al. تجزئة تحت الخلايا لخلايا ابيضاض الدم الليمفاوية المزمنة الأولية لمراقبة تهريب البروتين النووي / السيتوبلازمي. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تحضير الكسور الخلوية من خلايا سرطان الدم وهي طريقة لتوليد الكسور الخلوية والنووية من خلايا سرطان الكريات. يمكن استخدام الكسور النووية والسيتوبلازمية لمزيد من التحليل النهائي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الكسور تحت الخلوية من خلايا CLL

ملاحظة: عند التخطيط للإعداد التجريبي ، قم بتضمين بئر من الخلايا غير المحفزة / غير المعالجة التي يمكن من خلالها توليد مستخلص الخلية بالكامل.

  1. قم بإجراء التحفيز المطلوب و / أو العلاج الدوائي لخط خلايا MEC1 CLL أو خلايا CLL الأولية المعزولة باستخدام 10 - 20 × 106 خلايا / حالة. سيتم بعد ذلك استخدام الخلايا للتجزئة تحت الخلوية أو لتوليد مستخلص الخلية الكاملة كما هو موضح أدناه:
  2. تحضير المحاليل / الأنابيب: قم بإعداد جميع المحاليل / المخازن المؤقتة طازجة في يوم التجزئة قبل حصاد الخلايا. قم بتخزين المحاليل على الثلج لحين الحاجة واستخدمها في غضون 4 ساعات من التحضير.
    1. محلول مثبطات PBS / الفوسفاتيز: تحضير مثبطات الفوسفاتيز في PBS عن طريق تخفيف مثبطات الفوسفاتيز 1:20 في 1x PBS (أي 0.5 مل من مثبطات الفوسفاتيز في 9.5 مل من 1x PBS).
      ملاحظه: تأكد من عدم ترسيب مثبطات الفوسفاتيز. في حالة وجود راسب ، سخنيها إلى 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. المخزن المؤقت منخفض التوتر: قم بإعداد 1x Buffer منخفض التوتر عن طريق عمل تخفيف 1:10 من 10x buffer hypotonic في الماء المقطر (أي 50 ميكرولتر من 10x Buffer hypotonic إلى 450 μ لتر من dH2O).
    3. 10 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT): قم بإعداد 10 ملي مولار DTT عن طريق عمل تخفيف 1: 100 من 1M DTT بالماء المقطر (أي 10 ميكرولتر من 1 M DTT في 990 ميكرولتر من dH2O).
      ملاحظه: DTT متقلب للغاية ، لذا قم بإعداده طازجا في كل مرة. تجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة.
    4. المخزن المؤقت الكامل للتحلل: تحديد مقدار المخزن المؤقت المطلوب لكل تجربة. تتطلب كل عينة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الكامل للتحلل ، لذا أضف 5 ميكرولتر من 10 ملي مولار DTT إلى 44.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ثم أضف 0.5 ميكرولتر من كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني. يمكن زيادة هذا المبلغ اعتمادا على عدد العينات في التجربة.
    5. قم بتسمية أربع مجموعات من أنابيب الطرد الدقيق سعة 1.5 مل لكل تحفيز و / أو علاج دوائي للخلايا المحفزة حديثا ، والكسور السيتوبلازمية المتولدة حديثا ، والكسور النووية المتولدة حديثا ، ومحللات الخلية بأكملها. قم بتبريد أنابيب الطرد الدقيق هذه مسبقا على الجليد لحين الحاجة.
  3. انقل الخلايا إلى أنابيب وبيليه دقيق سعة 1.5 مل مصنفة بشكل فردي عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من مثبطات PBS / الفوسفاتيز الباردة المثلجة. قم بتكبيل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية واحتفظ بحبيبات الخلية على الجليد.
  4. تحضير الكسور السيتوبلازمية: أعد تعليق كريات الخلية برفق لاستخدامها في التجزئة تحت الخلوية في 50 ميكرولتر من 1x Buffer منخفض التوتر. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا بالانتفاخ.
    ملاحظه: يمكن زيادة حجم المخزن المؤقت منخفض التوتر المستخدم تجريبيا اعتمادا على عدد الخلية.
    1. أضف 0.8 - 2.5 ميكرولتر (1:20 إلى 1:60) من المنظف في كل عينة ودوامة على أعلى إعداد لمدة 10 ثوان.
      1. لتحديد التركيز الأمثل للمنظف لاستخدامه لنوع معين من الخلايا لعزل الكسور النووية والسيتوبلازمية ، قم بإجراء تدرج المنظف في البداية. يجب أن يكون النطاق من 1:20 إلى 1:60 (أي 2.5 ميكرولتر إلى 0.8 ميكرولتر من المنظفات إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت منخفض التوتر) كافيا.
        ملاحظه: إذا تم ضبط حجم المخزن المؤقت منخفض التوتر في الخطوة 3.4 ، فتأكد من الحفاظ على نسبة المنظف المناسبة.
      2. تحقق من تحلل الخلايا من خلال مراقبة الخلايا باستخدام مجهر تباين الطور قبل وبعد إضافة المنظف. تظهر الخلايا الكاملة أكبر مع نواة كثيفة ومظلمة. سيظهر السيتوبلازم على شكل هالة ساطعة حول النواة.
        ملاحظه: يتم تأكيد التحلل المناسب أيضا باستخدام النشاف الغربي لتحليل بروتينات معينة داخل الكسور المحللة الناتجة عن تدرج المنظف.
    2. بمجرد التحلل ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 14,000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية.
    3. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب ميكروفوج مبرد مسبقا ومسمى. يمكن تخزين هذا الجزء السيتوبلازمي عند -80 درجة مئوية حتى يلزم إجراء مزيد من التحليل. تحتوي الحبيبات المتبقية على الكسر النووي.
      ملاحظه: تجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة للعينات.
  5. تحضير الكسور النووية: أعد تعليق كل حبيبات نووية في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل الكامل عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: يمكن ضبط حجم المخزن المؤقت للتحلل الكامل تجريبيا وفقا لرقم خلية البداية.
    1. أضف 2.5 ميكرولتر من المنظف لإذابة البروتينات المرتبطة بالغشاء النووي والدوامة على أعلى إعداد لمدة 10 ثوان ، احتضان العينات على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    2. دوامة على أعلى إعداد لمدة 30 ثانية ، ثم الطرد المركزي للعينات عند 14,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب ميكرو فوج مبرد مسبقا ومسمى. يمكن تخزين هذا الجزء النووي عند -80 درجة مئوية حتى يكون ذلك ضروريا لمزيد من التحليل.
      ملاحظه: تجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة للعينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيق جرينر بيو واحد 616201 EDTA سيغما EDS لابنت VX100 فيشر ساينتيك دوار طقم مستخلص Nucelar الفكرة النشطة 40010 أقراص PBS فيشر ساينتيك BR0014G سيجما 3-16 ف SciQuip الطرد المركزي سيجما 1-15PK SciQuip الطرد المركزي

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة