مقايسة التدفق خارج الخلية: طريقة لقياس المظهر الأيضي للخلايا

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Hlozkova K. et al. تقييم الملف الأيضي لخلايا سرطان الدم الأولية. J. Vis. Exp. (2018).

يوفر هذا البروتوكول نهجا كيميائيا حيويا لقياس معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) لخلايا سرطان الدم الأولية مع مقايسة التدفق خارج الخلية. يساعد تقييم الملف الأيضي لهذه الخلايا على توصيف متطلباتها ، مما يؤدي إلى العلاج الشخصي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف

1. قم بإعداد 500 مل من PBS عن طريق إذابة 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، 4.3 ملي Na₂HPO₄ ، 1.47 ملي هيلو هيلومتري₂PO₄ ، في ddH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك التعقيم عن طريق التعقيم.
2. تحضير 100 مل من وسط RPMI: متوسط RPMI-1640 مع L-Alanyl-Glutamine مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل).
3. تحضير 50 مل من 0.1 M NaHCO₃ في الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.1 ، وقم بتعقيم الفلتر (0.22 ميكرومتر) وتخزينه عند 4 درجات مئوية < br / > ملاحظه: بالنسبة للوحين لمحلل التدفق خارج الخلية 8 آبار ، قم بإعداد 250 ميكرولتر من 0.1 M NaHCO₃ pH 8.1.
4. تحضير 1 مل من 2 م D-glucose في الماء المقطر. تعقيم الفلتر (0.22 ميكرومتر) وتخزينه في -20 درجة مئوية.
5. تحضير 100 ميكرولتر من 1 ملي مولار أوليغومايسين أ في الإيثانول. تعقيم الفلتر (0.22 ميكرومتر) وتخزينه في -20 درجة مئوية.
6. تحضير 250 ميكرولتر من 1 M 2-deoxy-D-glucose (2-DG) في الحد الأدنى من DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco). يسخن إلى 37 درجة مئوية ويضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 (قم بقياس الأس الهيدروجيني عند 37 درجة مئوية). تعقيم الفلتر (0.22 ميكرومتر) وتخزينه في -20 درجة مئوية.
7. تحضير 100 ميكرولتر من 1 ملي مولار FCCP (الكربونيل سيانيد - ب - ثلاثي فلورو الميثوكسي فينيل هيدرازون ) في DMSO. تعقيم الفلتر (0.22 ميكرومتر) وتخزينه في -20 درجة مئوية.
8. تحضير 100 ميكرولتر من 1 ملي مولار من الروتينون في الإيثانول. تعقيم الفلتر (0.22 ميكرومتر) وتخزينه في -20 درجة مئوية.
9. تحضير 100 ميكرولتر من 1 مجم / مل أنتيمايسين أ في الإيثانول. تعقيم الفلتر (0.22 ميكرومتر) وتخزينه في -20 درجة مئوية.
10. قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعداد 10 مل من وسط اختبار إجهاد تحلل السكر. قم بتسخين الحد الأدنى من DMEM إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 (قم بإجراء قياس الأس الهيدروجيني عند 37 درجة مئوية).
11. قبل الاستخدام ، قم بإعداد 10 مل من وسيط اختبار الإجهاد Cell Mito مع BSA. مكمل Minimal DMEM مع 2 ملي مولار ل-جلوتامين ، 10 ملي مولار د-جلوكوز ، 1 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 7.4) ، 1 ملي بيروفات و 0.1٪ BSA (ألبومين مصل الأبقار). يسخن إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي ويضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 (قم بقياس الأس الهيدروجيني عند 37 درجة مئوية).
12. قبل الاستخدام ، قم بإعداد 10 مل من وسط اختبار الإجهاد Cell Mito بدون BSA. مكمل الحد الأدنى من DMEM مع 2 ملي مولار ل-جلوتامين ، 10 ملي مولار د-جلوكوز ، 1 ملي هيبس (درجة الحموضة 7.4) و 1 ملي بيروفات. وسيط اختبار الإجهاد ميتو الخلية الدافئة بدون BSA إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 (قم بإجراء قياس الأس الهيدروجيني عند 37 درجة مئوية).
    ملاحظة: تمت إضافة BSA إلى وسيط اختبار الإجهاد Cell Mito لأن الخلايا تستجيب بشكل أفضل ل FCCP عندما يتم استكمال الوسيط ب BSA (تم اختبار ظروف مختلفة). يتم استخدام وسيط اختبار الإجهاد Cell Mito بدون BSA لتحميل المنافذ حيث لا توصي الشركة المصنعة باستخدام BSA في الوسط.

< p class = "jove_title" >2. زراعة الخلايا أحادية النواة بين عشية وضحاها

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات الفرعية في غطاء زراعة الأنسجة المعقمة.

1. قم بإعداد قارورتين T75 بسعة 20 مل من RPMI. أضف إلى كل قارورة 30 × 10⁶ خلايا أحادية النواة معزولة. احتضان الخلايا مع الوقوف على القارورة لمدة 16-24 ساعة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 37 درجة مئوية.

فئة < p = "jove_title" >3. تحضير الألواح المطلية بالمواد اللاصقة للخلية

1. قم بتغطية لوحين لمحلل التدفق خارج الخلية 8 آبار.
   ملاحظه: قم بإجراء الطلاء في غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة.
2. أضف 2.2 ميكرولتر من لاصق الخلية (الكثافة: 2.54 مجم / مل) إلى 250 ميكرولتر من 0.1 M NaHCO₃ ، درجة الحموضة 8.1 ، والماصة على الفور 12.5 ميكرولتر من المحلول في كل ب><ئر. ملاحظه: يمكن أن تختلف محاليل مخزون لاصق الخلايا في كثافتها ، اضبط الحجم المضاف إلى NaHCO₃ وفقا لذلك.
3. اترك الألواح في الغطاء لمدة 20 دقيقة تقريبا ، ثم اسحب لاصق الخلية واغسل كل منها جيدا مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من الماء المعقم. اتركه في غطاء المحرك مع فتح الغطاء حتى تجف الآبار.
4. استخدم الألواح على الفور أو وفر ما يصل إلى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية مع لف الحافة بغشاء البارافين لتجنب التكثيف. تأكد من تسخين الألواح إلى درجة حرارة الغرفة (لمدة 20 دقيقة تقريبا) في الغطاء قبل زرع الخلايا.

فئة

4. ترطيب خرطوشة الاستشعار

ملاحظة: قم بترطيب خرطوشتين لمحلل التدفق خارج الخلية ب 8 آبار.

1. افصل لوحة المرافق عن خرطوشة المستشعر. ضع خرطوشة المستشعر رأسا على عقب على مقعد المختبر.
2. املأ كل بئر من لوحة المرافق بسمك 200 ميكرولتر. املأ كل خندق حول الجزء الخارجي من الآبار ب 400 ميكرولتر من الفرجار.
3. أعد خرطوشة المستشعر إلى لوحة المرافق التي تحتوي الآن على الفرجار.
4. ضع مجموعة الخرطوشة في حاضنة رطبة غير تحتوي على 2 أكسيد الكربون ، 37 درجة مئوية طوال الليل.
5. قم بتشغيل محلل التدفق خارج الخلية واتركه دافئا إلى 37 درجة مئوية طوال الليل.

< p class = "jove_title" >5. بذر الخلايا في ألواح لاصقة للخلايا

ملاحظة: لاختبار إجهاد تحلل السكر ، استخدم وسيط اختبار إجهاد تحلل السكر. لاختبار الإجهاد Cell Mito ، استخدم وسيط اختبار الإجهاد Cell Mito مع BSA.

1. خلايا البذور لاختبار إجهاد تحلل السكر واختبار الإجهاد الخلية ميتو في لوحات منفصلة. لكل اختبار ، استخدم خلايا من قارورة واحدة مع مزرعة ليلية.
2. خلايا الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط المناسب وعدادها.
3. أضف 4 × 10⁶ من الخلايا الحية إلى الحجم النهائي البالغ 400 ميكرولتر (استخدم الوسط المناسب).
4. لوحة 50 ميكرولتر من الخلية معلقة داخل آبار [ب-غ]. تأكد من زرع 500,000 خلية في بئر واحد.
   ملاحظه: من الأهمية بمكان زرع 500,000 خلية بالضبط لكل بئر حيث لا يتم إجراء أي تطبيع آخر. بهذه الطريقة ، يمكن مقارنة النتائج من مرضى مختلفين. العدد الأمثل للتكرارات هو ستة ، كما هو موضح هنا. لا ينصح باستخدام عدد أقل من التكرارات لأن الخلايا الأولية قد تتصرف بشكل خاطئ في بعض الأحيان.
5. أضف 180 ميكرولتر من الوسط المناسب إلى الآبار A و H (ستكون هذه الآبار بمثابة تصحيح للخلفية).
6. قم بالطرد المركزي للوحة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع ضبط الفرامل على 1.
7. أضف 130 ميكرولتر من الوسط المناسب إلى الآبار BG في لوحين محلل تدفق خارج الخلية 8 آبار ببطء وبعناية. تأكد بصريا من أن الخلايا ملتصقة بثبات بقاع الآبار من خلال المشاهدة تحت المجهر.
8. ضع اللوحة في حاضنة رطبة غير تحتوي على ثاني أكسيد الكربون₂ ، 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

< p class = "jove_title" >6. تحميل خرطوشة المستشعر

1. لاختبار إجهاد تحلل السكر ، قم بإعداد 250 ميكرولتر لكل من 100 ملي مولار جلوكوز و 20 ميكرومتر من أوليغومايسين أ و 1 م 2-DG ، كل ذلك في وسط اختبار إجهاد تحلل السكر.
2. بالنسبة لاختبار الإجهاد الخلية ميتو ، قم بإعداد 250 ميكرولتر لكل من 20 ميكرومتر من Oligomycin A و 15 ميكرومتر FCCP و 30 ميكرومتر FCCP ومزيج من 10 ميكرومتر من Rotenone و 10 ميكروغرام / مل Antimycin A ، كل ذلك في وسط اختبار الإجهاد Cell Mito بدون BSA.
   ملاحظه: يوصى بحقن تركيزين من FCCP في اختبار واحد نظرا لعدم وجود مواد كافية للمرضى لمعايرة FCCP. ومع ذلك ، يجب تحديد التركيزات من قبل الباحث.
3. قم بتحميل المركبات في منافذ الحاقن المناسبة للخرطوشة على النحو التالي (الجدول 1):

7. إعداد البرنامج

1. بالنسبة لاختبار إجهاد تحلل السكر ، قم بإعداد البرنامج كما هو موضح في الجدول 2.
2. بالنسبة لاختبار الإجهاد Cell Mito ، قم بإعداد البرنامج كما هو موضح في الجدول 3.
3. ابدأ البرنامج. استبدل لوحة الكيبرينت بلوحة الفحص (عند المطالبة).

ميناء اختبار إجهاد تحلل السكر اختبار إجهاد الخلية تحميل إلى المنفذ التركيز النهائي في الآبار تحميل إلى المنفذ التركيز النهائي في الآبار أ 20 ميكرولتر من 100 ملي مولار جلوكوز 10 ملي مولار جلوكوز 20 ميكرولتر من 20 ميكرومتر أوليغومايسين أ 2 ميكرومتر أوليغومايسين أ ب 22 ميكرولتر من 20 ميكرومتر أوليغومايسين أ 2 ميكرومتر أوليغومايسين أ 22 ميكرولتر من 15 ميكرومتر FCCP 1.5 ميكرومتر FCCP ج 25 ميكرولتر من 1 م 2-DG 100 ملم 2-DG 25 ميكرولتر من 30 ميكرومتر FCCP 4.5 ميكرومتر FCCP د س 25 ميكرولتر من 10 ميكرومتر من الروتنون و 10 ميكروغرام / مل أنتيمايسين أ 1 ميكرومتر روتينون و 1 ميكروغرام / مل أنتيمايسين أ

الجدول 1: الأحجام المركبة.

درج اعدادات المعايره تلقائي التوازن تلقائي قياس خط الأساس ثلاث مرات: امزج - 3 دقائق ، انتظر - 0 دقيقة ، قياس - 3 دقائق حقن المنفذ أ حقن قياس ثلاث مرات: امزج - 3 دقائق ، انتظر - 0 دقيقة ، قياس - 3 دقائق حقن المنفذ B حقن قياس ثلاث مرات: امزج - 3 دقائق ، انتظر - 0 دقيقة ، قياس - 3 دقائق حقن المنفذ C حقن قياس أربع مرات: امزج - 3 دقائق ، انتظر - 0 دقيقة ، قياس - 3 دقائق

الجدول 2: برنامج اختبار إجهاد تحلل السكر.

درج اعدادات المعايره تلقائي التوازن تلقائي قياس خط الأساس ثلاث مرات: امزج - 3 دقائق ، انتظر - 0 دقيقة ، قياس - 3 دقائق حقن المنفذ أ حقن قياس ثلاث مرات: امزج - 3 دقائق ، انتظر - 0 دقيقة ، قياس - 3 دقائق حقن المنفذ B حقن قياس ثلاث مرات: امزج - 3 دقائق ، انتظر - 0 دقيقة ، قياس - 3 دقائق حقن المنفذ C حقن قياس ثلاث مرات: امزج - 3 دقائق ، انتظر - 0 دقيقة ، قياس - 3 دقائق حقن المنفذ D حقن قياس ثلاث مرات: امزج - 3 دقائق ، انتظر - 0 دقيقة ، قياس - 3 دقائق

الجدول 3: برنامج اختبار الإجهاد الخلية ميتو.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلل فرس البحر XFp تقنيات Agilent S7802A فرس البحر XFp ثقافة الخلية صفيحة صغيرة تقنيات Agilent 103025-100 خلية Corning™ Cell-Tak خلية لاصقة وأنسجة لاصقة ثيرموفيشر العلمي CB40240 D- (+) الجلوكوز سيجما ألدريتش G7021-100G أوليغومايسين أ سيجما ألدريتش 75351-5 ملغ 2-ديوكسي-د-جلوكوز سيجما ألدريتش D8375-1G FCCP سيجما ألدريتش سي 2920-10 ملغ روتينون سيجما ألدريتش R8875-1G Antimycin A من Streptomyces sp. سيجما ألدريتش أ 8674-25 ملغ فرس البحر XF قاعدة متوسطة، 100 مل تقنيات Agilent 103193-100 محلول L-glutamine ، 200 ملي مولار سيجما ألدريتش G7513-100 مل