تخصيب الخلايا التائية: تقنية لعزل الخلايا التائية من الخلايا المختلطة عن طريق الفصل المغناطيسي

الملخص

المصدر: Nguyen، H. D.، et al. منصة زرع نخاع العظام للتحقيق في دور الخلايا المتغصنة في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف. J. Vis. Exp. (2020).

يصف هذا الفيديو تخصيب الخلايا التائية من طحال الفأر عن طريق التحديد السلبي باستخدام فاصل مغناطيسي. تتضمن هذه التقنية استهداف الخلايا الأخرى في العينة للنضوب باستخدام الأجسام المضادة أو الروابط الموجهة ضد مستضدات سطح الخلية المحددة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. اليوم 1: تحضير الخلايا التائية من الفئران المانحة

1. استخدم الفئران CD45.2 ⁺ H2k^{b +} C57BL / 6 من النوع البري (WT) كمتبرعين للخلايا التائية.
2. قتل الفئران C57BL / 6 عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون (CO₂) وانتظر لمدة 2-3 دقيقة حتى تفقد الوعي. إجراء خلع عنق الرحم كقتل رحيم ثانوي إذا لزم الأمر.
3. نظف فراء وجلد الماوس جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول. استئصال الطحال والغدد الليمفاوية وفصلها إلى معلق خلية واحدة من خلايا الطحال باستخدام مكبس حقنة ومصافي شبكية 40 ميكرومتر. اغسل المصفاة ومكبس الحقنة باستخدام 1٪ RPMI (1٪ FBS يحتوي على وسائط RPMI) لجمع جميع خلايا الطحال.
4. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف 5 مل من المخزن المؤقت للتحلل ACK (1 ملي مولار Na₂EDTA ، 10 ملي مولار KHCO₃ ، 144 ملي NH₄Cl ، درجة الحموضة 7.2) بعد التخلص من المادة الطافية. احتضان تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يستخدم المخزن المؤقت لتحلل ACK لتحلل خلايا الدم الحمراء.
5. أضف 5 مل من 1٪ RPMI لوقف التحلل. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. قم بإعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) (0.5٪ BSA ، 2 ملي مولار EDTA في PBS ، درجة الحموضة 7.2). قم بإزالة المخزن المؤقت قبل الاستخدام. أعد تعليق كريات الخلية في 5 مل من المخزن المؤقت MACS.
7. عد خلايا الطحال وتحقق من الخلايا الحية والميتة باستخدام مقياس كثافة الدم و 1٪ تريبان بلو. احفظ حصة من 2 × 10⁶ خلايا لتقييم عائد التنقية باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي.
8. أعد تعليق خلايا الطحال بتركيز 200 × 10⁶ / مل في المخزن المؤقت MACS. أضف 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضاد للفأر-Ter-119 ، و 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضاد للفأر-CD11b ، و 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضاد للفأر-CD45R ، و 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضاد للفأر-DX5 لكل 10⁶ خلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية < br / > ملاحظه: تم استخدام البيوتين المضاد للفأر-Ter-119 ، والبيوتين المضاد للفأر-CD11b ، والبيوتين المضاد للفأر-CD45R ، والبيوتين المضاد للفأر-DX5 للتفاعل مع الكريات الحمرية والخلايا المحببة والخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية على التوالي. لذلك ، يتم استنفاد هذه المجموعات الفرعية للخلايا في الخطوة التالية.
9. أضف 10 مل من المخزن المؤقت MACS المثلج إلى تعليق الخلية. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
10. أعد تعليق كريات الخلية في المخزن المؤقت MACS بتركيز 100 × 10⁶ / مل. أضف الميكروبيدات المضادة للبيوتين (0.22 ميكرولتر / 10⁶ خلايا) إلى معلق خلايا الطحال. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 15 دقيقة إضافية عند 4 درجات مئوية. اغسل تعليق الخلية مرة واحدة باستخدام 10 مل من محلول MACS المثلج. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
11. ضع عمود فصل مغناطيسي في المجال المغناطيسي. اشطف العمود ب 3 مل من المخزن المؤقت MACS. قم بإسقاط تعليق الخلية على العمود. اجمع التدفق الذي يتكون من خلايا تائية غير مرتبطة ومخصبة ، في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. اغسل عمود MS ب 3 مل من MACS المخزن المؤقت المثلج.
    ملاحظه: تأكد من أن العمود فارغ قبل تنفيذ خطوات الغسيل.
12. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من المخزن المؤقت MACS.
13. عد الخلايا باللون الأزرق 1٪ باستخدام مقياس كثافة الدم. احفظ حصة من 2 × 10⁶ خلايا لفحص النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظه: متوسط إنتاجية الخلايا التائية الطحالية المعزولة بهذه الطريقة هو ~ 20-25 × 10⁶ خلايا لكل فأر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات RPMI 1640 ثيرمو فيشر العلمي 11875-093 وسائط ميدي ماكس ميلتيني بيوتيك 130-042-302 إثراء الخلايا التائية 0.5 م EDTA درجة الحموضة 8.0 100 مل فيشر ساينتيك BP2482100 مخزن MACS المؤقت 10X PBS فيشر ساينتيك ص3994 مخزن MACS المؤقت الميكروبيدات المضادة للبيوتين ميلتيني بيوتيك 130-090-485 إثراء الخلايا التائية مضاد للإنسان / ماوس CD45R (B220) ثيرمو فيشر العلمي 13-0452-85 إثراء الخلايا التائية مضاد للفأر CD4 البيوتين ثيرمو فيشر العلمي 13-0041-86 إثراء الخلايا التائية CD11b ثيرمو فيشر العلمي 13-0112-85 إثراء الخلايا التائية CD25-البيوتين ثيرمو فيشر العلمي 13-0251-82 إثراء الخلايا التائية CD45R ثيرمو فيشر العلمي 13-0452-82 إثراء الخلايا التائية CD49b الجسم المضاد أحادي النسيلة (DX5) - البيوتين ثيرمو فيشر العلمي 13-5971-82 إثراء الخلايا التائية البيوتين المضاد للفأر TER-119 ثيرمو فيشر العلمي 13-5921-85 إثراء الخلايا التائية مضاد للماوس CD45.1 PE ثيرمو فيشر العلمي 12-0900-83 تحليل قياس التدفق الخلوي C57BL / 6 فئران نهر تشارلز 27 المانحون/المستفيدون أنابيب قياس التدفق الخلوي فيشر ساينتيك 352008 تحليل قياس التدفق الخلوي مصفاة الخلية 40 ميكرومتر ثيرمو فيشر العلمي 22363547 تحضير الخلية