توليد الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام: طريقة لتوليد الخلايا المتغصنة من نخاع عظم الفأر

الملخص

المصدر: Nguyen، H. D.، et al. منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا المتغصنة في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف. J. Vis. Exp.. (2020).

يصف هذا الفيديو بروتوكولا لتوليد الخلايا المتغصنة - الخلايا الرئيسية التي تقدم المستضد والتي تنشط الخلايا التائية - من نخاع عظم الفأر البالغ.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد خلايا شجيرية مشتقة من نخاع العظام (BM-DCs).

1. اعزل نخاع العظم عن عظم الفخذ والظنبوب WT أو الفئران العامل B (fB) ^{- / -} على خلفية B6. باختصار ، اجمع الساق وعظم الفخذ من كلا الساقين باستخدام الملقط والمقص. ضعها في RPMI مثلج يحتوي على 1٪ FCS و 100 وحدة / مل بنسلين / ستربتومايسين و 2 ملي من L-glutamine (1٪ RPMI) في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. نظف عظم الفخذ وعظام الساق جيدا عن طريق إزالة جميع أنسجة العضلات باستخدام الملقط والمقص. انقل عظم الفخذ والساق من الأنابيب المخروطية سعة 50 مل إلى طبق بتري بقطر 92 مم يحتوي على 1٪ RPMI. باستخدام المقص ، قم بقص أطراف عظم الفخذ أو الساق. املأ أنبوبا سعة 50 مل ب 25 مل من وسط 1٪ RPMI 1640. استخدم هذا لملء حقنة سعة 3 مل متصلة بإبرة 26 جم بسعة 3 مل من 1٪ RPMI. أدخل هذه المحقنة في العظم وادفع المكبس لطرد نخاع العظم (BM) من التجويف إلى أنبوب التجميع بنسبة 1٪ RPMI (~ 3 مل / عظم). قم بتدوير الخلايا عند 800 × جم لمدة 5 دقائق.
2. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من محلول ACK لتحلل خلايا الدم الحمراء. احتضان معلق الخلية لمدة 5 دقائق على الجليد. أضف 10 مل من 1٪ RPMI إلى تعليق الخلية لإيقاف التحلل والطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. أعد تعليق كريات الخلية في 10 مل من وسائط الاستزراع (RPMI 1640 التي تحتوي على 10٪ FBS ، و 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 2 ملي مولار لجلوتامين ، و 50 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول) واضبط الحجم لتلبية التركيز النهائي 2 × 10⁶ خلايا / مل.
4. أضف 20 نانوغرام / مل عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والضامة (GM-CSF) إلى تعليق الخلية. زراعة خلايا نخاع العظم في أطباق بتري 100 × 15 مم عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 6 أيام.
5. استبدل نصف وسائط الاستزراع الجارية (حوالي 5 مل) بوسائط جديدة تحتوي على 40 نانوغرام/مل GM-CSF في اليوم 3.
6. قم بتسخين وسائط الاستزراع في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. اجمع حوالي 5 مل من الوسائط من أطباق زراعة نخاع العظم. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل وسائط مزرعة تحتوي على 40 نانوغرام / مل GM-CSF.
7. أضف 25 ميكروغرام / مل من عديد السكاريد الدهني (LPS) إلى الوسائط في اليوم 6 من المزرعة لتنضج BM-DCs. احفظ حصة من 2 × 10⁶ خلايا لتحديد فعالية تمايز التيار المستمر عن طريق قياس التدفق الخلوي.
8. اجمع BM-DCs الناضجة: استخدم رافعات الخلايا لكشط التيار المستمر برفق من أطباق بتري. اجمع كل معلقات الخلية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم ، لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اغسل كريات الخلية 3x مع 50 مل من PBS المثلج. وفر حوالي 2 × 10⁶ BM-DCs لتحليل النمط الظاهري المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي.

المواد