$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. التثبيت ، تحلل الخلايا ، وقص الكروماتين
ملاحظة: يتم إصلاح عينات المرضى وخلايا Jurkat ومعالجتها باستخدام مجموعة ChIP المتوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع التعديلات كما هو موضح سابقا. يتم إجراء التثبيت تحت غطاء التدفق الصفحي.
- قم بإعداد أنبوب سعة 1.5 مل مع 1 مل من 37٪ فورمالديهايد ، وأنبوب 1.5 مل مع 1 مل من 1.25 م جلايسين ، وأنبوب 5 مل مع 4 مل من 1x PBS وصندوق به ثلج لتثبيت الخلايا.
- بعد تحفيز الخلايا لوقت الحضانة المعني ، قم بتحفيز الخلايا بإضافة 32.4 نانومتر فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) و 1 ميكرومتر أيونوميسين. ثم احتضان الخلايا لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 مع فتح غطاء الأنبوب (لتجنب التلوث ، يمكن استخدام فيلم مانع للتسرب منفذ للهواء ، وتدوير الأنابيب سعة 5 مل عند 200 × جم لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS في أنابيب 5 مل.
- أضف 340 ميكرومتر من الفورمالديهايد (13.5 ميكرولتر من 37٪ فورمالديهايد) إلى الخلايا. بعد الخلط لفترة وجيزة عن طريق سحب العينة بعناية لأعلى ولأسفل ، احتضن المعلق لمدة 2.5 دقيقة (خلايا جوركات) أو 5 دقائق (عينة المريض) في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظه: هناك حاجة إلى وقت تثبيت طويل للخلايا الأولية لضمان القص الأمثل.
- أضف 125 ملي مولار جلايسين (57 ميكرولتر من 1.25 م جلايسين) لإيقاف التثبيت واحتضانه لمدة 5 دقائق أخرى. ضع الخلايا على الجليد بعد ذلك مباشرة وجهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط.
- اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من PBS المثلج عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية في كل مرة عن طريق الشفط.
ملاحظه: بعد التثبيت ، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا. يجب تخزين الخلايا الثابتة عند -80 درجة مئوية. للاختبار ، إذا لم يتم إخفاء حاتمة الجسم المضاد المراد استخدامه في البروتوكول التالي عن طريق التثبيت ، فيمكن استخدام عينات إضافية للتحليل عبر الرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE واللطخة الغربية. يتم تنفيذ هذه الخطوات باستخدام 100 ميكروغرام من البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يتم استخدام جميع الأجسام المضادة αNFAT2 عند تخفيف 1: 1000 ، والجسم المضاد GAPDH عند تخفيف 1: 10000. تظهر صورة نموذجية لعينات ثابتة من خلايا جوركات ذات الأجسام المضادة المناسبة وغير المناسبة في الشكل 1.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من محلول التحلل المتاح تجاريا 1 عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، ضع العينات على الجليد على شاكر واحتضنها لمدة 10 دقائق أثناء الرج.
ملاحظه: قبل التحلل ، يمكن تفكيك الخلايا لمدة 10 ثوان في النيتروجين السائل. هذا مفيد لخلايا جوركات ولكن يجب تجنبه في عينات المرضى الأولية. للتفكك ، ضع الأنابيب سعة 5 مل لمدة 5 ثوان في 5-10 مل من النيتروجين السائل في وعاء معين. ارتد نظارات السلامة وقفازات السلامة المناسبة.
- بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق سحب العينات.
- قم بتجانس الخلايا في 5 مل من المخزن المؤقت للتحلل المتاح تجاريا 2 عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل واحتضانها لمدة 10 دقائق على الجليد أثناء الرج. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق سحب العينات.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر (خلايا جوركات) أو 140 ميكرولتر (عينات المريض) من مخزن القص 1 الذي يحتوي على 1x مثبط للبروتياز (5 ميكرولتر أو 1.4 ميكرولتر ، على التوالي) واحتضان الخليط لمدة 10 دقائق على الجليد.
- لقص الكروماتين ، انقل 140 ميكرولتر من تعليق الخلية من الخطوة 1.9 إلى أنابيب الصوتنة (تجنب إنتاج فقاعات الهواء وكرر هذه الخطوة إذا لزم الأمر بسبب حجم العينة). ضع الأنابيب في جهاز الموجات فوق الصوتية المركز عند درجة حرارة 7 درجات مئوية والقص لمدة 10 دقائق (خط الخلية) أو 7.5 دقيقة (عينات المريض) بمتوسط قوة حادثة 9.375 واط للحصول على شظايا الحمض النووي 200-500 نقطة أساس.
- أخيرا ، جهاز الطرد المركزي عند 15700 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز الطرد المركزي الصغير وجمع المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
- لاختبار أحجام الشظايا المناسبة ، قم بتحليل 20 ميكرولتر من الكروماتين المنفصم عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي في 1.5٪ من هلام الاغاروز TBE. تظهر صورة نموذجية للكروماتين المنفصم من خلايا Jurkat ذات الجودة الجيدة والسيئة في الشكل 2. في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا. يجب تخزين الكروماتين المقطوع عند -80 درجة مئوية.
