مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين: تقنية لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي في الخلايا

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Fuchs، A. R.، et al. A اختبار الترسيب المناعي للكروماتين لتحديد الجينات المستهدفة الجديدة ل NFAT2 في سرطان الدم الليمفاوي المزمن. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو بروتوكول اختبار الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ، وهي تقنية كلاسيكية لإثبات تفاعلات البروتين والحمض النووي. تستخدم هذه التقنية لتحديد الجينات المستهدفة في خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن البشري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الكروماتين المناعي

ملاحظة: تم إجراء الترسيب المناعي للكروماتين باستخدام مجموعة ChIP المتوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع التعديلات.

1. احسب عدد الترسبات المناعية (70 ميكرولتر (خلايا جوركات) أو 15 ميكرولتر (عينات المرضى) من الكروماتين المنفصم بالإضافة إلى جسم مضاد واحد) وقم بإعداد 20 ميكرولتر من حبات البروتين A المغلفة لكل ترسيب في أنبوب 1.5 مل. اغسل الخرزات في 40 ميكرولتر من 1x ChIP buffer 1 لكل هطول الأمطار عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ، واترك الخرزات ترتاح في رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينات. قم بتنفيذ هذه الخطوة أربع مرات في المجموع. في النهاية ، أعد تعليق الخرزات في وحدة التخزين الأصلية باستخدام 1x ChIP buffer 1.
2. بالنسبة للترسيب المناعي نفسه ، استخدم 10 ميكروغرام من الجسم المضاد αNFAT2 (7A6) لالتقاط NFAT2 بتسلسلاته المستهدفة المرتبطة. استخدم 2.5 ميكروغرام من الجسم المضاد IgG للأرانب (DA1E) كعنصر تحكم في IgG. تحضير التفاعلات في أنابيب جديدة سعة 1.5 مل كما هو موضح في الجدول 1.
   ملاحظة: من المهم استخدام جسم مضاد وحيد النسيلة ذو تقارب عال لا يتم إخفاء حاتمة أثناء تثبيت هذا البروتوكول. تقدم الأجسام المضادة متعددة النسيلة مستوى إضافيا من التباين مما يجعل تفسير النتائج المستلمة بشكل مناسب أكثر صعوبة.
3. احتضن الخليط من الخطوة 1.2 طوال الليل عند 4 درجات مئوية على عجلة دوارة عند 6 دورات في الدقيقة.
4. في اليوم التالي ، قم بتدوير الأنابيب لمدة 5 ثوان عند 7,000 × جم في جهاز الطرد المركزي الصغير ، واحتضنها في رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط. اغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام كل من مخازن الغسيل 1 و 2 و 3 و 4 على التوالي.
5. للقيام بذلك ، قم بتعليق الخرزات في 350 ميكرولتر من عازلة الغسيل واحتضانها لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية على عجلة دوارة عند 6 دورات في الدقيقة.
6. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب لمدة 5 ثوان عند 7000 × جم في جهاز الطرد المركزي الصغير. ثم ضعها لمدة 1 دقيقة في رف مغناطيسي ، وقم بإزالة المادة الطافية وأضف مخزن الغسيل التالي.
7. بعد خطوة الغسيل الأخيرة ، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الماصة ، واحمل الخرزات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف 1 واحتضنها لمدة 30 دقيقة على عجلة دوارة عند 6 دورات في الدقيقة.
8. قم بتدوير الأنابيب بعد فترة وجيزة (5 ثوان عند 7000 × جم في جهاز الطرد المركزي الصغير) وضعها في رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
9. ثم انقل المادة الطافية عن طريق سحب العينة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل وأضف 4 ميكرولتر من محلول الشطف 2.
10. لإنشاء عنصر التحكم في الإدخال ، امزج 1 ميكرولتر من الكروماتين المنفصم مع 99 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف 1 و 4 ميكرولتر من عازلة الشطف 2 (في هذا الإعداد ، هناك ثلاثة أنابيب لكل مريض: عنصر تحكم واحد في الإدخال ، وعنصر تحكم IgG وعينة واحدة من αNFAT2).
11. احتضان العينات لمدة 4 ساعات عند 65 درجة مئوية و 1300 دورة في الدقيقة في شاكر أنبوبي سعة 1.5 مل. أضف 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ ، والدوامة وقم بتدوير العينات لمدة 5 ثوان عند 7000 × جم في جهاز الطرد المركزي الصغير.
12. قم بتعليق الخرزات المغناطيسية المتاحة عن طريق الدوامة تماما ، وأضف 10 ميكرولتر من الخرزات إلى كل عينة واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة عند 6 دورة في الدقيقة.
13. بعد الحضانة ، قم بتدوير الأنابيب لمدة 5 ثوان عند 7000 × جم في جهاز الطرد المركزي الصغير وضعها لمدة 1 دقيقة في رف مغناطيسي. قم بإزالة المادة الطفية عن طريق الشفط.
14. أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من عازلة الغسيل 1. اقلب الأنابيب للخلط واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة عند 6 دورة في الدقيقة.
15. قم بتدوير الأنابيب لمدة 5 ثوان عند 7000 × جم في جهاز الطرد المركزي الصغير، وضعها لمدة دقيقة واحدة في رف مغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينات. كرر الخطوات 2.13-2.14 مع المخزن المؤقت للغسيل 2.
16. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل عن طريق الشفط ، وأعد تعليق الخرزات في 55 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على العجلة الدوارة عند 6 دورات في الدقيقة لتصفية الحمض النووي المترسب. أخيرا ، قم بتدوير الأنابيب لمدة 5 ثوان عند 7000 × جم في جهاز الطرد المركزي الصغير ، وضعها لمدة دقيقة واحدة في رف مغناطيسي وانقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل.
    ملاحظه: هنا يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا. يجب بعد ذلك تخزين الحمض النووي الملطوب عند -20 درجة مئوية.

بند وحدة التخزين (μL) لكل IP 5٪ BSA 6 100 × مثبط البروتياز 3 5 × مخزن مؤقت ChIP 1 56 الكروماتين المنفصم x (15 ميكرولتر أو 70 ميكرولتر) الخرز المغناطيسي المطلي بالبروتين أ 20 ChIP seq الصف المياه 185 - س - ص الجسم المضاد (αNFAT2 أو التحكم في IgG) y (1.09 ميكرولتر أو 1 ميكرولتر) مجموع 270 ريال

الجدول 1: الجدول الزمني لسحب الترسيب المناعي للكروماتين. تم إجراء الترسيب المناعي للكروماتين عن طريق تحضير التفاعلات كما هو موضح في الجدول.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الأجسام المضادة ل NFAT2 الكسيس 1008505 استنساخ 7A6 الأجسام المضادة ل NFAT2 إشارات الخلية 8032 ثانية استنساخ D15F1 الأجسام المضادة المضادة ل NFAT2 ChIP الصف أبكام أب2796 استنساخ 7A6 رف مغناطيسي ، مغناطيس DynaMag-15 الترمو: العلمية 12301 د يمكن استبدالها بأدوات مماثلة مجموعة iDeal ChIp-seq ل Histones دياجينود C01010059 جهاز طرد مركزي صغير الترمو: العلمية هيرايوس فريسكو 17 يمكن استبدالها بأدوات مماثلة شاكر ديوماكس 1030 أدوات هايدولف 543-32205-00 يمكن استبدالها بأدوات مماثلة كوكتيل هلت البروتياز ومثبطات الفوسفاتيز (100X) الترمو: العلمية 78440 IRDye 680LT الحمار IgG المضاد للأرانب (H + L) ، 0.5 مجم LI-COR للعلوم البيولوجية 926-68023 IRDye 800CW الماعز IgG المضاد للفأر (H + L) ، 0.1 مجم LI-COR للعلوم البيولوجية 925-32210 أنبوب DNA LoBind 1.5 مل إيبندورف 22431021 FBS متفوقة ميرك S0615 37 ٪ الفورمالديهايد p.a., ACS روث 4979.1 1 × برنامج تلفزيوني سيجما ألدريتش د8537 M220 الموجات فوق الصوتية المركزة كوفاريس 500295 20X بولت MES SDS تشغيل العازلة الترمو: العلمية ب 0002 تريس محلول ملحي مخزن (TBS-10X) إشارات الخلية #12498 جهاز نقل جل iBlot 2 الترمو: العلمية IB21001 iBlot 2 Transfer Stacks ، نيتروسليلوز ، الحجم العادي الترمو: العلمية ب 23001 جهاز طرد مركزي كبير إيبندورف 5804 ص يمكن استبدالها بأدوات مماثلة