استزراع وحصاد استنساخ HSPC: طريقة للحصول على استنساخ HSPC المصنفة بشكل فردي

الملخص

المصدر: Huber، A. R.، et al. توصيف الحمل الطفري والتركيب النسيلي للدم البشري. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو بروتوكول عزل HSPCs من نخاع العظام وفرزها باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت ، وهي طريقة للحصول على HSPCs التي تم فرزها بشكل فردي. نقوم بزراعة هذه الخلايا المصنفة للحصول على استنساخ HSPC.

البروتوكول

1. عزل HSPC وفرزها وثقافها

1. قم بالدوران عند 1-2 × 10⁷ خلايا أحادية النواة لمدة 5 دقائق عند 350 × جم وأعد تعليقها في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ مضاد ل CD3 (تخفيف 1: 100 من الجسم المضاد المضاد للقرص المضغوط في المخزن المؤقت FACS). نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
   ملاحظة: عند الفرز باستخدام >2 × 10⁷ خلايا ، قم بزيادة مزيج الأجسام المضادة وأحجام المخزن المؤقت FACS وفقا لذلك.
2. تحضير 50 ميكرولتر من مزيج تلطيخ 2x HSC وفقا للوصفة الموضحة في الجدول 1
3. امزج 50 ميكرولتر من محلول الخلية مع مزيج تلطيخ HSC المحضر واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو لمدة ساعة واحدة على الجليد حتى ترتبط الأجسام المضادة.
4. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت والحبيبات FACS عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 350 × جم.
5. أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بتصفية تعليق الخلية من خلال أنبوب بوليسترين سعة 35 ميكرومتر مغطى بمصفاة خلية سعة 5 مل لإزالة كتل الخلايا قبل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS).
6. تحضير 25 مل من وسط استزراع HSPC ، يتكون من 1x وسط SFEM مكمل ب 100 نانوغرام / مل SCF ، 100 نانوغرام / مل Flt3 ، 50 نانوغرام / مل TPO ، 10 نانوغرام / مل IL-3 ، 20 نانوغرام / مل IL- 6 ، و 100 نانوغرام / مل تركيبة المضادات الحيوية (انظر جدول المواد).
7. املأ لوح زراعة خلايا 384 بئر ب 75 ميكرولتر من وسط زراعة HSPC في كل بئر.
   ملاحظة: لمنع تبخر الوسط في الآبار الخارجية ، املأ الآبار الخارجية ب 75 ميكرولتر من الماء المعقم أو PBS ، ولا تستخدم هذه الآبار لفرز الخلايا.
8. فرز HSPCs مفردة
   1. قم بتعيين بوابات لفرز HSPC بناء على عنصر تحكم غير ملطخ (HSCs مرتبة منفردة) و 10,000 خلية من العينة الملطخة. تم تصوير نتيجة تمثيلية لإعداد البوابات في الشكل 1. قم بتوصيل الخلايا المفردة عن طريق رسم بوابة حول ارتفاع FSC الخطي مقابل كسر منطقة FSC. استخدم جزء التحكم غير الملوثة لرسم بوابة ^لكسر النسب. ارسم بوابات لخلايا CD34 ⁺ وقم بتمييز هذه المجموعة الفرعية بشكل أكبر عن طريق تعيين بوابة محددة لخلايا CD38^- CD45RA-.
   2. قم بتحميل لوحة البئر 384 على جهاز FACS وفرز الخلايا المفردة.
      ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا على جهاز FACS، فقم بالتبديل إلى خيار الاحتفاظ ببيانات فرز الفهرس لتمكين إعادة تتبع الخلايا التي تم فرزها.
9. زراعة HSCs المصنفة بشكل فردي
   1. انقل صفيحة البئر 384 مباشرة إلى حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
      ملاحظه: لمنع التبخر أثناء الزراعة ، لف لوحة ثقافة البئر 384 (بغطاء) في غلاف شفاف من البولي إيثيلين.
   2. احتفظ بلوحة البئر 384 في الحاضنة لمدة 3-4 أسابيع حتى تظهر المستنسخة المرئية. تم تصوير الصور التمثيلية للثقافة النسيلة في الشكل 2. بناء على حالة مادة الإدخال ، فإن 5٪ -30٪ من الخلايا التي تم فرزها ستتوسع بشكل استنساخي.

جسم الحجم [μL] BV421-CD34 5 مزيج FITC-Lineage (CD3 / 14/19/20/56) 5 PE-CD38 2 APC- CD90 0.5 بير سي بي / سي 5.5 - CD45RA 5 PE / Cy7- CD49f 1 فيتك -CD16 1 FITC-CD11 5 FACS المخزن المؤقت 25.5 دولار

الجدول 1: مزيج فرز HSC.يظهر جدول يشير إلى تخفيفات الأجسام المضادة المستخدمة لفرز الخلايا الحساسة السرطانية.

< p class = "jove_title" >2. حصاد استنساخ HSPC

1. بعد 4 أسابيع من الزراعة ، حدد الآبار التي يبلغ التقاء 30٪ أو أعلى.
2. قم بالتعبئة المسبقة (لكل نتوء نسيلي) 1.5 مل من الأنابيب الدقيقة مع 1 مل من 1٪ BSA في PBS وقم بتسمية الأنبوب وفقا للبئر المقابل.
3. قم بترطيب طرف الماصة مسبقا مع 1٪ من BSA في PBS لتقليل عدد الخلايا الملتصقة بطرف الماصة.
4. قم برفع / أسفل الوسط في البئر بشدة (5 مرات على الأقل) باستخدام ماصة 200 ميكرولتر (مثبتة على 75 ميكرولتر) وكشط قاع البئر لفك الخلايا في البئر ، وجمع تعليق الخلية في الأنبوب الدقيق المسمى المقابل للبئر.
5. امتص 75 ميكرولتر من BSA الطازج بنسبة 1٪ في PBS وكرر سحب العينات في البئر لضمان أقصى امتصاص للخلايا.
   ملاحظة: يمكن أن تلتصق الخلايا المستنثرة بقاع البئر. افحص الآبار باستخدام مجهر ضوئي مقلوب قياسي للتأكد مما إذا كان قد تم جمع جميع الخلايا.
6. إذا تم حصاد جميع الآبار ذات التقاء >30٪ ، فضع صفيحة البئر 384 مرة أخرى في الحاضنة. يمكن أن تتكاثر الثقافات النسيلة لمدة تصل إلى 5 أسابيع.
7. قم بتدوير تعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 350 × جم. يجب أن تكون الحبيبات الصغيرة مرئية.
8. قم بإزالة كل المادة الطافية بعناية باستثناء حوالي 5 ميكرولتر. يمكن تجميد كريات الخلية عند -20 درجة مئوية وتخزينها لعدة أشهر قبل عزل الحمض النووي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: مخطط انسيابي يصور الإجراء التجريبي بناء على المواد المدخلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: استراتيجية فرز الخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات CD11c FITC بيو ليجند 301603 استنساخ 3.9 CD16 FITC بيو ليجند 302005 استنساخ 3G8 CD3 BV650 بيو ليجند 300467 استنساخ UCHT1 CD34 BV421 بيو ليجند 343609 561 ريال CD38 PE بيو ليجند 303505 استنساخ HIT2 CD45RA بيركب / سي 5.5 بيو ليجند 304121 استنساخ HI100 CD49f PE / Cy7 بيو ليجند 313621 استنساخ GoH3 CD90 APC بيو ليجند 328113 استنساخ 5E10 مصفاة الخلية أنبوب 5 مل كورنينج 352235 لوح سيلستار، 384 واط، 130 ميكرولتر، F-أسفل، TC، غطاء غرينر 781182 الإنسان Flt3-Ligand ، درجة ممتازة ميلتيني للتكنولوجيا الحيوية 130-096-479 التكرار في حصص الاستخدام الواحد (25 ميكرولتر) عند 100 ميكروغرام / مل في 0.1٪ BSA في PBS IL-3 المؤتلف البشري (الإشريكية القولونية المفعول) تقنيات الخلايا الجذعية 78040.1 التوافق في حصص الاستخدام الواحد (2.5 ميكرولتر) عند 100 ميكروغرام/مل في 0.1٪ BSA في PBS IL-6 المؤتلف البشري (الإشريكية القولونية) تقنيات الخلايا الجذعية 78050.1 التوافق في حصص الاستخدام الواحد (5 ميكرولتر) عند 100 ميكروغرام/مل في 0.1٪ BSA في PBS SCF البشري ، من الدرجة الممتازة ميلتيني للتكنولوجيا الحيوية 130-096-695 التكرار في حصص الاستخدام الواحد (25 ميكرولتر) عند 100 ميكروغرام / مل في 0.1٪ BSA في PBS TPO البشري ، درجة ممتازة ميلتيني للتكنولوجيا الحيوية 130-095-752 التوافق في حصص الاستخدام الواحد (12.5 ميكرولتر) عند 100 ميكروغرام / مل في 0.1٪ BSA في PBS النسب (CD3 / 14/19/20/56) FITC بيو ليجند 348701 المستنسخة: UCHT1 ، HCD14 ، HIB19 ، 2H7 ، HCD56 برنامج تلفزيوني صنع في منشأة المعهد. يمكن أيضا استخدام PBS المتاح تجاريا بريموسين إنفيفوجين النمل PM-1 تركيبة المضادات الحيوية