$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
عزل خلايا c-Kit + من نخاع العظام
- التضحية بالفئران وفقا للإرشادات المؤسسية.
ملاحظة: هنا ، تعرضت الفئران لثاني أكسيد الكربون (CO2) وفقا لمعدل التدفق الموصى به من AVMA حتى تم تحديد الوفاة عن طريق توقف التنفس وضربات القلب ، متبوعا بخلع عنق الرحم.
- احصد عظام الساق من الفأر — عظمان عظميان ، واثنان من الظنبوب ، واثنين من الحرقفية. نظف جميع الأنسجة من العظام عن طريق كشطها بمشرط. ضع عظام الساق في بارد 1x PBS على الجليد - 5 مل في أنبوب سعة 15 مل. صب محتويات الأنبوب في الهاون وسحقها مع مدقة.
- قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية سعة 70 ميكرومتر في أنبوب غطاء لولبي سعة 50 مل مع ماصة سعة 10 مل متصلة باستخدام ماصة. اغسل الهاون والمدقة عدة مرات باستخدام 1x PBS بارد ، مع جمع وإضافة تعليق الخلية إلى أنبوب 50 مل. قم بتدوير نخاع العظم عند 1,200 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق مكنسة كهربائية مع ماصة زجاجية متصلة. قم بتعليق حبيبات الخلية في 5 مل من 1x PBS باستخدام ماصة.
- باستخدام ماصة ، أضف نخاع العظم المعلق ببطء إلى الجزء العلوي من 5 مل من درجة حرارة الغرفة (درجة الحرارة حرجة) عديد السكروز ، مع الحرص الشديد على عدم إزعاج الواجهة. قم بالدوران عند 400 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع إيقاف تشغيل الفرامل.
- اجمع واجهة الخلية أحادية النواة الكلية الغائمة (TMNC) باستخدام ماصة وضعها في أنبوب جديد سعة 15 مل. ارفع الحجم إلى 10 مل مع 1x PBS للغسيل ، مع أخذ 20 ميكرولتر للعد ، والدوران عند 1,200 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية واحفظ الحبيبات على الجليد للخطوة 4.6.1.
- قم بإجراء عزل الخلايا c-Kit +.
- اتبع بروتوكول مجموعة microbead لعزل الخلايا c-Kit +. أعد تعليق حبيبات الخلية في 80 ميكرولتر من 1x PBS + EDTA + BSA إلى 107 خلايا. إلى تعليق الخلية ، أضف 20 ميكرولتر من CD117 MicroBeads / 107 خلايا إجمالية. تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتحتضن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ارفع الحجم إلى 10 مل عن طريق إضافة 1x PBS + EDTA + BSA وقم بالدوران عند 1,200 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية عبر فراغ حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر / 108 خلايا إجمالية في 1x PBS + EDTA + BSA. باستخدام حامل المغناطيس مع العمود المغناطيسي المرفق ، أضف 3 مل من 1x PBS + EDTA + BSA واتركه يتدفق عبر الجاذبية إلى أنبوب تجميع سعة 15 مل.
- بمجرد الانتهاء من مرور الإضافة العازلة الأولى عبر العمود ، أضف تعليق الخلية إلى العمود ، مما يسمح له بالتدفق عبر الجاذبية إلى أنبوب التجميع سعة 15 مل. هذا التدفق هو جزء الخلية غير المرغوب فيه.
- اغسل العمود 3 مرات باستخدام 3 مل 1x PBS + EDTA + BSA في كل مرة ، مما يسمح له بالتدفق عبر الجاذبية إلى أنبوب التجميع. قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه في الجزء العلوي من أنبوب سعة 15 مل.
- أضف 5 مل من 1x PBS + EDTA + BSA وقم بشطفه على الفور باستخدام المكبس المرفق مع العمود. قم بإزالة المكبس وكرر التدفق مع 5 مل إضافية من 1x PBS + EDTA + BSA. عد الخلايا في وحدة التخزين الإجمالية باستخدام الطرق القياسية.
- قم بتدوير الخلايا عند 1,200 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في IMDM كامل (IMDM + 10٪ FBS + IL-6 [10 نانوغرام / مل] + mSCF [50 نانوغرام / مل] + FLT3 ligand [20 نانوغرام / مل] + IL-3 [10 نانوغرام / مل]) للاستزراع. قم بزراعة هذه الخلايا طوال الليل في 2 × 106 خلايا / 1 مل من وسائط IMDM الكاملة للخلية عن طريق وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.