التنبيغ بوساطة الفيروسات القهقرية: طريقة لإدخال الجين المستهدف في الخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Kesarwani ، M. ، et al. طرق تقييم دور c-fos و dusp1 في اعتماد الأورام. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو بروتوكول التحقق الجيني عن طريق نقل الجينات المستهدفة باستخدام الفيروسات القهقرية في خطوط خلايا ابيضاض الدم النخاعي المزمن. تعمل الفيروسات القهقرية كوسيط لنقل المادة الوراثية إلى خلية سرطان الدم من خلال عملية تسمى التنبيغ ، والتي تتيح التعبير طويل المدى عن الجين المستهدف. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي خلايا مستهدفة للتحقق الجيني والتطوير العلاجي.

البروتوكول

1. التنبيغ

1. تعداء البلازميد الفيروسي القهقري
   1. قم بإذابة خلايا HEK293 حديثا بعد الظهر السابق في حمام مائي على 37 درجة مئوية. قم بتدوير أنبوب التبريد الذي يحتوي على خلايا HEK عند 435 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق فراغ حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS والبنسلين والستربتومايسين والجلوتامين.
   2. عد الخلايا وأضف الحجم المناسب إلى طبق معالج مقاس 10 سم (~ 4 × 10⁶ خلايا HEK293T). أضف 14 مل من وسائط DMEM 10 إلى الطبق واخلطها جيدا عن طريق الانزلاق لأعلى ولأسفل للحصول على توزيع متساو. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ طوال الليل.
   3. في صباح اليوم التالي ، تحقق من التقاء الخلايا تحت مجهر ضوئي مقلوب (50٪ أو أكثر يعمل بشكل جيد).
   4. اجمع بين الحمض النووي (البلازميد الفيروسي القهقري المرغوب فيه) ، و PclEco (بلازميد التغليف) ، و 2 M CaCl₂ ، و H₂0 في أنبوب سعة 1.5 مل (= 500 ميكرولتر) باستخدام ماصة دقيقة بالكميات التالية: 7.5 ميكروغرام من الحمض النووي (BCR-ABL1-YFP) ، 7.5 ميكروغرام من pCLeco ، 62 ميكرولتر من 2 M CaCl₂ ، والماء إلى حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر. أضف 500 ميكرولتر من 2x HBS إلى أنبوب آخر سعة 1.5 مل.
   5. أضف مزيج الحمض النووي بالتنقيط إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من 2x HBS (280 ملي كلوريد الصوديوم ، و 100 ملي مولار HEPES ، و 1.5 ملي Na₂HPO₄) أثناء الخلط. حقق ذلك عن طريق ضبط دوامة على أدنى سرعة وتثبيت أنبوب HBS عليها للخلط المستمر أثناء إضافة مزيج التعداد.
   6. اترك مزيج التعداء يحتضن لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، أضف 25 نانومتر من الكلوروكين إلى خلايا HEK وضعها مرة أخرى في الحاضنة. بعد الحضانة ، أضف مزيج التعدي بالتنقيط إلى خلايا HEK ، ثم قم بتدوير الوسائط برفق لخلط مزيج التعداء في جميع أنحاء اللوحة.
   7. احتضان الخلايا بالمزيج لمدة ~ 8 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. قم بتغيير الوسائط الموجودة على هذه الخلايا عن طريق إضافة 14 مل ببطء شديد من وسائط DMEM 10 الجديدة. يساعد السحب ببطء على جدار الطبق على منع أي تجريد من خلايا HEK. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   8. اجمع المادة الطافية الفيروسية بحقنة سعة 10 مل ، واسحب المادة الطافية في المحقنة ، وقم بتوصيل مرشح المحقنة 0.45 ميكرومتر. اغمر المادة الطافية الفيروسية في أنبوب تجميع جديد. خذ المجموعة الأولى من المواد الطافية الفيروسية ~ 16 ساعة لاحقا.
2. تركيز فيروسي الفيبرونيكتين ونقله
   1. أضف 2 مل من جزء فيبرونيكتين بشري مؤتلف 0.1 مجم في 1x PBS إلى ألواح مزرعة 6 آبار غير معالجة. قم بإعداد أكبر قدر ممكن من الفيبرونيكتين حسب الحاجة ، والذي يعتمد على عدد الخلايا والأنماط الجينية. يمكن لبئر واحد أن ينقل بشكل كاف 10 ملايين خلية c-Kit +. احتضان الطبق طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   2. في اليوم التالي ، قم بإزالة الفيبرونيكتين من الآبار باستخدام ماصة ، وماصة 2 مل من BSA المعقم 2٪ في 1x PBS لمنع اللوحة ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة BSA عبر مكنسة كهربائية واغسلها جيدا عن طريق سحب 2 مل من 1x PBS ثم قم بإزالتها عبر مكنسة كهربائية.
   3. أضف على الفور مادة طافية فيروسية طازجة تم جمعها وتصفيتها (عند 0.45 ميكرومتر) حتى 5 مل. جهاز طرد مركزي عند 435 × جم عند 32 درجة مئوية لمدة ساعتين. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق مكنسة كهربائية وكرر هذه الخطوة باستخدام مادة طافية فيروسية إضافية تم جمعها حديثا وقم بتدويرها مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق فراغ وغسل الآبار بإضافة 2 مل من 1x PBS ؛ ثم قم بإزالته عن طريق الفراغ.
   4. أضف خلايا الفأر c-Kit + التي تم زراعتها بين عشية وضحاها عن طريق تدوير الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات في IMDM كامل للثقافة. قم بزراعة هذه الخلايا طوال الليل في 2 × 10⁶ خلايا / 1 مل من وسائط IMDM الكاملة للخلية عن طريق وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) إلى الآبار المطلية بالفيروسات عن طريق خلط معلقات الخلية جيدا وإخراجها في صفيحة الفيبرونيكتين المركزة الفيروسية الآن. تدور عند 1,200 × جم عند 25 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. ضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
   بعد
   5. 48 ساعة من التنبيغ ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1,200 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها في المخزن المؤقت FACS # 1 (1x PBS + 0.5٪ BSA) إلى 6 × 10⁶ / مل. تحديد النسبة المئوية للخلايا الموجبة BCR-ABL1 عن طريق قياس النسبة المئوية ل YFP الإيجابية باستخدام قياس التدفق الخلوي.
   6. الحصول على الأحداث مع الإجراء القياسي. أولا ، قم ببوابة الخلايا الحية بناء على التشتت الأمامي والجانبي. بعد ذلك ، قم ببوابة الخلايا الحية الموجبة YFP باستثناء الخلايا السالبة YFP التي تحددها التحكم السلبي (الشكل 1).

النتائج

الشكل 1: FACS يوضح تواتر خلايا YFP + من دم الفأر المزروع والفأر WT (التحكم السلبي). تظهر اللوحات العلوية مخططا مبعثرا للخلايا والبوابات. تظهر اللوحات السفلية الرسوم البيانية ل YFP مقابل التشتت الجانبي. تم اعتبار الخلايا ذات MFI >10³ YFP +. تم استخدام بوابات مماثلة لخلايا نخاع العظام بعد التنبيغ لحساب النسبة المئوية للتحويل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM سيلجرو (كورنينج) 15-013-السيرة الذاتية جزء فيبرونيكتين البشري المؤتلف RetroNectin تاكارا تي 100 ب FBS أتلانتا البيولوجية S11150 بنسلفانيا / البكتيريا سيلجرو (كورنينج) 30-002-CI ل-جلوتامين سيلجرو (كورنينج) 25-005-CL 5 مجم / مل مخزون في الماء هيبس سيغما H7006 برنامج تلفزيوني كورنينج 21040 سي في Na2HPO4.7H2O سيغما الطراز S9390 كلوريد الكالسيوم إنفيتروجين K278001 2x HBS إنفيتروجين K278002 EDTA أمبيون AM9261 جيش صرب البوسنه سيغما أ 7906 ثقافة الإنسان على المدى الطويل بدء فحص الخلية تقنيات خلية ستيمب عداد الخلايا الآلي TC-10 بيو راد ROSACreERT2 / c-Fos fl / fl Dusp1 -/- صنع في المنزل ROSACreERT2 / c-Fosfl / فلوريدا صنع في المنزل ROSACreERT2 مختبر جاكسون C57Bl / 6 مختبر جاكسون خلايا CML-CD34+ و CD34+ العادية مستشفى الجامعة ، جامعة سينسيناتي LSR II (محلل FACS) دينار بحريني فورتيسا الأول (محلل FACS) دينار بحريني FACSAriaII (فارز FACS) دينار بحريني حاضنة نابكو من سلسلة 8000 WJ CO2 حراري علمي سيتريفوج دوار دلو التأرجح 5810R إيبندورف 1/2 سم مكعب حقنة أنسولين U-100 Lo-Dose 28 G1 / 2 بيكتون ديكنسون بيكتون ديكنسون هيدروكورتيزون الصوديوم هيميسوكسينات تقنيات الخلايا الجذعية 7904 GM-CSF بروسبيك سي آي تي -221 ز-SCF بروسبيك سي آي تي -220 IL-3 البشري بروسبيك سي يت-210 SCF البشري بروسبيك سي آي تي -255 إريثروبويين أمجين 5513-267-10 BD Perm / Wash (محلول النفاذية والغسيل لتدفق الفوسفو) دينار بحريني 554723 BD Cytofix / Cytoperm (محلول التثبيت والنفاذية) دينار بحريني 554714 بي دي فارم ليز دينار بحريني 555899 70 ميكرومتر من النايلون خلية stariner بيكتون ديكنسون هاتف: 352350 مرشح قرص acro 0.45 ميكرومتر سطل 2016-10