مقالة منهجية

مقايسة CFU المستندة إلى ميثيل السليلوز: طريقة لتحديد تأثير المركبات المضادة للسرطان على تكوين المستعمرة في خلايا سرطان الدم

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Kesarwani ، M. ، et al. طرق تقييم دور c-fos و dusp1 في اعتماد الأورام. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو بروتوكول وحدة تكوين المستعمرة القائمة على ميثيل السليلوز أو مقايسة CFU ، والتي تساعد في تحديد وحساب عدد المستعمرات التي تشكلها خلايا سرطان الدم استجابة للعلاج بالمركبات المضادة للسرطان.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. فحوصات وحدة تشكيل المستعمرة

  1. قم بإذابة ميثيل السليلوز بالسيتوكينات للفأر في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. قم بفرز الخلايا الإيجابية ل YFP على فارز الخلايا.
  2. قم بتدوير الخلايا لأسفل وتعليق الحبيبات في وسائط IMDM الكاملة. عد الخلايا المراد طلاؤها وتخفيفها للحصول على 5,000 خلية إيجابية YFP في 100 ميكرولتر من وسائط IMDM الكاملة.
  3. أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلية الذي يحتوي على 5,000 خلية إيجابية YFP والمثبطات المناسبة إلى 3 مل من ميثيل السليلوز. دوامة على ارتفاع لخلطها لمدة 10-30 ثانية.
  4. بعد هروب معظم فقاعات الهواء ، استخدم حقنة سعة 1 مل للوحة 1 مل من الوسائط في ثلاث ألواح مكررة مقاس 3 سم عن طريق إخراج الوسائط على جانب واحد وإمالة اللوحة ببطء في حركة دائرية لتنتشر بالتساوي.
  5. التركيز النهائي للمثبطات المراد استخدامها هو إيماتينيب عند 3 ميكرومتر ، و DFC عند 0.2 ميكرومتر ، و BCI عند 0.5 ميكرومتر ، بمفرده أو في مجموعات. عند الاقتضاء ، احذف c-Fos عن طريق طلاء الخلايا ب 4-هيدروكسي تاموكسيفين (1 ميكروغرام / مل) مضاف إلى ميثيل السليلوز.
  6. بعد الطلاء ، ضع الأطباق في طبق بتري كبير مع طبق واحد مفتوح يحتوي على 2 مل من الماء المعقم في المنتصف. غطي طبق بتري الكبير واحتضنه بعناية عند 37 درجة مئوية ، حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 بنسبة 5٪. سجل أرقام المستعمرات بعد أسبوع واحد من الطلاء عن طريق حساب العدد الإجمالي للمستعمرات تحت المجهر.
  7. تحليل عدد قليل من المستعمرات من اللوحات المناسبة لحذف c-Fos بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل اجمع المستعمرات عن طريق امتصاصها بطرف P1000. قم بإزاحة الخلايا في 500 ميكرولتر من 1x PBS عن طريق غسل الطرف في PBS عدة مرات. قم بتدوير معلقات الخلية عند 6,000 × جم لمدة 1 دقيقة واستخرج الحمض النووي من حبيبات الخلية باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الجيني.
  8. استخدم الحمض النووي الجيني ل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات mFos-FP3 و mFos-RP5. قم بتحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على جل الاغاروز بنسبة 2٪ والصورة باستخدام نظام توثيق الجل.
  9. للحصول على عرض رسومي للمستعمرات ، قم بتلطيخ المستعمرات باستخدام كلوريد اليودونيتتروتيرازوليوم. قم بإذابة 10 مجم من كلوريد اليودونيتتروتيرازوليوم في 10 مل من الماء للحصول على محلول 1 مجم / مل. قم بتعقيم المحلول باستخدام قفل Luer مع مرشح 0.2 ميكرومتر متصل بحقنة سعة 10 مل في ظل ظروف معقمة في غطاء زراعة الأنسجة.
  10. في غطاء زراعة الأنسجة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التلوين بالتنقيط حول لوحة CFU ؛ احرص على عدم الانزلاق أو إزعاج المستعمرات. احتضان الألواح طوال الليل في حاضنة زراعة خلايا 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. سوف تتحول المستعمرات إلى اللون البني المحمر الداكن. باستخدام خلفية بيضاء في غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة ، التقط صورا للوحة CFU الملطخة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات IMDM سيلجرو (كورنينج) 15-016-CVR MethoCult GF M3434 (ميثيل السليلوز لوحدة تشكيل الرأس المالي) الخلايا الجذعية 3434 4-هيدروكسي تاموكسيفين سيغما H6278 المؤتلف الفئران SCF بروسبيك سي آي تي -275 المؤتلف الفأر FLT3-Ligand بروسبيك سي يت-340 المؤتلف الفئران IL-6 بروسبيك سي آي تي -350 المؤتلف الفئران IL-7 بيبروتك 217-17 DFC مختبرات LKT Inc. د3420 بي سي آي كيمزون العلمية نيوزيلندا-06-195 إيماتينيب مختبر LC I-5508 1x برنامج تلفزيوني سيلجرو (كورنينج) 21-040-السيرة الذاتية 1/2 سم مكعب حقنة أنسولين U-100 Lo-Dose 28 G1 / 2 بيكتون ديكنسون 329461 كلوريد اليودونيتتروتيرازوليوم سيغما رقم I10406 الصكوك حاضنة نابكو من سلسلة 8000 WJ CO2 حراري علمي سيتريفوج دوار دلو التأرجح 5810R إيبندورف C-1000 دراجة حرارية بيو راد نظام التصوير ChemiDoc (نظام تصوير للمواد الهلامية والبقع الغربية) بيو راد 17001401 فئران ROSACreERT2 مختبر جاكسون ROSACreERT2 / c-Fos fl / fl Dusp1-/ صنع في المنزل ROSACreERT2 / c-Fosfl / فلوريدا صنع في المنزل

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CFU

مقالات ذات صلة