الانتقاء المناعي السلبي: طريقة لتنقية الخلايا البائية من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة

الملخص

المصدر: Serra S. et al. الاختبار المستند إلى HPLC لمراقبة استقلاب النيوكليوتيدات / النيوكليوزيد خارج الخلية في خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن البشري. J. Vis. Exp. (2016)

يشرح الفيديو طريقة لتنقية الخلايا البائية عن طريق الاستهداف المناعي المغناطيسي والفصل عن تعليق خلايا الدم المحيطية أحادية النواة. تتضمن الطريقة وضع العلامات على أنواع الخلايا غير المرغوب فيها بأجسام مضادة أو روابط محددة (مرتبطة بجسيمات مغناطيسية) تستهدف بروتينات سطح خلية معينة ، ليتم استنفادها من تعليق الخلية غير المتجانسة عن طريق الفصل المغناطيسي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تنقية الخلايا البائية اللوكيمية عن طريق العزل السلبي

1. أعد تعليق 10⁷ PBMCs / مل في PBS 0.1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) 2 ملي مولار EDTA ، درجة الحموضة 7.4 (عازلة العزل).
2. أضف 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة للفأر المضادة ل CD3 و -CD14 و -CD16 ل 10⁷ خلايا واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
3. اغسل الخلايا بمخزن العزل وجهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للعزل عند 10⁷ PBMCs/ml.
5. قبل الحضانة بالخلايا ، قم بتعليق الخرز المغناطيسي IgG المضاد للفأر في القارورة. انقل 100 ميكرولتر من الخرز لكل 10⁷ خلايا إلى أنبوب.
6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للعزل وضع الأنبوب في حامل مغناطيسي لمدة 1 دقيقة. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 5 مل.
7. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس وأعد تعليق الخرزات المغسولة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعزل.
8. احتضان 10⁷ خلايا مع 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع إمالة ودوران لطيفين.
9. ضع الأنبوب في حامل المغناطيس لمدة دقيقتين وانقل المادة الطافية باستخدام الخلايا غير المرتبطة CD19 ⁺/CD5⁺ إلى أنبوب جديد بماصة سعة 5 مل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات دم الإنسان منقى مضاد ل CD3 ، -CD14 ، -CD16 صنع في المنزل فأر أحادي النسيلة Dynabeads الأغنام المضادة للفأر IgG إنفيتروجين هاتف 11031 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أمريسكو E404-200TABS اقراص ألبومين مصل الأبقار (BSA) السيرة الذاتية للمعرف 1000-70 الصف القياسي عازل العزل PBS 0.1٪ BSA 2 ملي EDTA ، درجة الحموضة 7.4 مغناطيس DynaMag-15 إنفيتروجين 12301 د فاصل حبة مغناطيسية دينال