استقلاب البيورين خارج الخلية: اختبار قائم على HPLC لقياس توليد الأدينوزين والتمثيل الغذائي في خلايا سرطان الدم

الملخص

المصدر: Serra S et al. اختبار قائم على HPLC لمراقبة استقلاب النيوكليوتيدات / النيوكليوزيد خارج الخلية في خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن البشري. J. Vis. إكسب. (2016)

يشرح هذا الفيديو طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور العكسي الكمي (RP-HPLC) لقياس التمثيل الغذائي للأدينوزين والبيورينات المرتبطة به الناتجة عن استهلاك AMP في بيئة خارج الخلية للخلايا السرطانية سرطان سرطان الكريات. يصف البروتوكول مقايسة RP-HPLC حساسة ومحددة وموثوقة وقابلة للتكرار تم تطويرها والتحقق من صحتها من أجل القياس الكمي لنيوكليوتيدات البيورين خارج الخلية والنيوكليوسيدات التي تنتجها خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن المنقى (CLL) في ظل ظروف استزراع مختلفة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير حلول مخزون المعيار والمثبطات

1. لتحضير AMP ، قم بوزن 0.00345 جم من AMP وقم بإذابه في 5 مل من الوسط الخالي من المصل للحصول على محلول قياسي 2 ملي مولار من AMP.
2. لتحضير ADO ، قم بوزن 0.00265 جم من ADO وقم بإذابه في 5 مل من الوسط الخالي من المصل للحصول على محلول قياسي 2 ملي مولار من ADO.
3. لتحضير INO ، قم بوزن 0.00268 جم من INO وقم بإذابه في 5 مل من الوسط الخالي من المصل للحصول على محلول قياسي 2 ملي مولار من INO.
4. قم بإعداد محلول 400 ميكرومتر من AMP و ADO و INO عن طريق خلط 1 مل من محلول المرق 2 مم في 4 مل من الوسط الخالي من المصل (الحجم النهائي 5 مل).
   1. قم بإجراء تخفيف 1: 4 لكل محلول قياسي 400 ميكرومتر للحصول على تركيز 100 ميكرومتر عن طريق سحب 500 ميكرولتر من محلول 400 ميكرومتر في 1,500 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل (الحجم النهائي 2 مل).
   2. تحضير التخفيفات التسلسلية لكل مركب في وسط خال من المصل للحصول على التركيزات التالية: 100 ميكرومتر - 50 ميكرومتر - 25 ميكرومتر - 10 ميكرومتر - 5 ميكرومتر - 2.5 ميكرومتر - 1 ميكرومتر - 0.5 ميكرومتر - 0.25 ميكرومتر < بري / > ملاحظة: على سبيل المثال، قم بتعبئة ماصة 1 مل من محلول 100 ميكرومتر في 1 مل من الوسط الخالي من المصل (تخفيف 1:2) للحصول على تركيز 50 ميكرومتر والمضي قدما في التخفيفات المتبقية.
5. قم بإعداد محلول مخزون 10 ملي من APCP المذاب في PBS ؛ الكمية والمخزون عند - 30 درجة مئوية.
6. تحضير 10 محاليل مخزون من هيدروكلوريد EHNA و dCF و dipyridamole المذاب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ؛ aliquot والمخزون عند -30 درجة مئوية.

2. برمجة طريقة HPLC

1. قم بإعداد عازلة أسيتات الأمونيوم 7 ملي مولار عن طريق إذابة 0.770 جم من أسيتات الأمونيوم في 2 لتر من الماء منزوع الأيونات المزدوج (العازلة أ). اضبط على درجة الحموضة 3.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
2. قم بإعداد زجاجة زجاجية تحتوي على 2 لتر على الأقل من الأسيتونيتريل فائق النقاء ل HPLC (Buffer B) وقم بتوصيل عمود الحماية والعمود ب HPLC.
   ملاحظة: الأعمدة والمخازن المؤقتة موجودة في RT أثناء الاستخدام.
3. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج HPLC وحدد الزر "تصفح المشروع". انتقل إلى قائمة "ملف" وحدد "طريقة جديدة" ثم "طريقة الأداة".
4. قم ببرمجة طريقة عمود التوازن وفقا للجدول 1. اضبط معدل تدفق 1.00 مل / دقيقة وقم ببرمجة كاشف الأشعة فوق البنفسجية للقراءة عند 260 نانومتر. احفظ طريقة الأداة وحدد مرة أخرى "طريقة جديدة" من قائمة "ملف" ثم "مجموعة الأساليب". اختر طريقة الأداة المحفوظة مسبقا واحفظ الطريقة الحالية التي تم تعيينها بنفس الاسم.
5. كرر الخطوة 2.3 لبرمجة طريقة نموذج التشغيل الموضحة في الجدول 2. اضبط معدل تدفق 1.00 مل / دقيقة وقم ببرمجة كاشف الأشعة فوق البنفسجية للقراءة عند 260 نانومتر. احفظ طريقة الأداة وكرر نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوة 4.4 لحفظ مجموعة الأساليب.
6. حدد الزر "تشغيل العينات" ، واختر "طريقة مجموعة عينة جديدة" من قائمة "ملف".
7. حدد خيار "فارغ" وأدخل رقم القارورة (في جهاز أخذ العينات الآلي) ، واسم العينة ، وحجم الحقن (50 ميكرولتر). حدد مجموعة الطرق المحفوظة من قبل لعمود "مجموعة الأساليب" وأدخل إجمالي وقت التشغيل (دقيقة).
   ملاحظة: أدخل طريقة عمود التوازن (الجدول 1) في عمود "مجموعة الأساليب" قبل كل تشغيل عينة وأدخل إجمالي وقت التشغيل (دقيقة).

< p class = "jove_title" >3. إنشاء منحنى معايرة قياسي لكل مركب

1. حقن 50 ميكرولتر من الفراغ (وسط محدد خال من المصل ، والذي لا يحتوي على الأدينوزين ديميناز) ومن كل عينة قياسية باتباع الطرق الموضحة في الجدول 1 والجدول 2.
   1. استخدم طريقة عمود التوازن (الجدول 1) قبل كل تشغيل عينة وقم بتعيين شروط التدرج الموضحة في الجدول 2 للحصول على فصل الذروة الكافي. راجع الجدول 3 للاطلاع على أوقات الاحتفاظ المبلغ عنها ل AMP و ADO و INO في ظل ظروف HPLC هذه.
   2. حدد منطقة الذروة ل AMP و ADO و INO بتركيزات مختلفة مع اختيار زر "العملية" في برنامج HPLC وبعد ذلك خيار "التكامل". بدلا من ذلك ، حدد يدويا نقطتي البداية والنهاية لكل ذروة.
   3. ارسم مناطق الذروة مقابل التركيز الاسمي لكل معيار للحصول على منحنى المعايرة المكون من تسع نقاط (100 ، 50 ، 25 ، 10 ، 5 ، 2.5 ، 1 ، 0.5 ، 0.25 ميكرومتر).
   4. احسب معادلة الخط المستقيم ل AMP و ADO و INO: y = mx + b ،
      حيث x هو تركيز μM و y يتوافق مع منطقة الذروة.
   الوقت معدل التدفق (مل / دقيقة) ٪أ ٪B 1.00 100 0 1.24 ب 1.00 100 0 6.22 [إ] 1.00 2 98 18.65 دولار 1.00 2 98

   الجدول 1: طريقة عمود التوازن. التمثيل التخطيطي لتغييرات المذيبات لتحقيق توازن العمود. المخزن المؤقت أ: 7 ملي مولار أسيتات الأمونيوم ، درجة الحموضة 3.0. العازلة ب: الأسيتونيتريل.

   الوقت معدل التدفق (مل / دقيقة) ٪أ ٪B 1.00 0 100 3.74 دولار أمريكي 1.00 0 100 13.71 دولار 1.00 15 85 17.00 1.00 100 0 20.00 1.00 100 0

   الجدول 2: تشغيل نموذج الطريقة. تمثيل تخطيطي لتغيرات المذيبات لقياس HPLC لمركبات البيورين. المخزن المؤقت أ: 7 ملي مولار أسيتات الأمونيوم ، درجة الحموضة 3.0. العازلة ب: الأسيتونيتريل.

   وقت الاستبقاء λ_ماكس امبير 8.00 دقيقة 260 د.م اينو 11.00 دقيقة 260 د.م أدو 11.90 دقيقة 260 د.م

   الجدول 3: أوقات الاحتفاظ بمركبات البيورين. أوقات الاحتفاظ النموذجية التي لوحظت ل AMP و ADO و INO. تمت برمجة كاشف الأشعة فوق البنفسجية للقراءة عند 260 نانومتر.

   < p class = "jove_title" >4. المعالجة المسبقة بالمثبطات والحضانة بالركيزة (AMP)
   1. لاختبار استهلاك AMP ، توليد ADO و INO دون تثبيط ناقلات CD73 و ADA والنيوكليوزيد ، قم بتعليق خلايا CLL المنقاة 2 × 10⁶ CD19 ^{+ /} CD5 ⁺ في 250 ميكرولتر من الخلايا المتوسطة الخالية من المصل والخلايا الصفيحية في صفيحة 48 بئر (أو في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل).
   2. أضف 250 ميكرولتر من مثبطات 400 ميكرومتر AMP أو AMP plus للحصول على تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومتر AMP. قم بتضمين شرط في حالة عدم وجود الركيزة لاستخدامها كعينة فارغة.
   3. احتضان من 30 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   4. في نهاية وقت الحضانة ، اجمع 500 ميكرولتر من المواد الطافية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الباردة (على الجليد) وجهاز الطرد المركزي على الفور عند 17,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
   5. انقل المواد الطافية في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 مل وقم بتخزينها على الفور عند -80 درجة مئوية أو انتقل إلى تحضير العينة لتشغيل HPLC.
   < p class = "jove_title" >5. تحضير العينات ل HPLC
   1. قم بتصفية المواد الطافية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة سعة 1.5 مل باستخدام مرشحات الحقنة 0.2 ميكرومتر. استخدم محاقن 1 مل للتصفية.
   2. إذا تم تزويد نظام HPLC بجهاز أخذ العينات التلقائي، فقم بإعداد القوارير الزجاجية ل HPLC واستخدم الإدخالات الدقيقة سعة 0.1 مل لكميات صغيرة من العينة.
   3. انقل ما لا يقل عن 100 ميكرولتر من العينة في القارورة الزجاجية باستخدام ماصة دقيقة أو ماصة باستور زجاجية. احرص على النقل بدون فقاعات وإغلاق القارورة بغطاء المسمار.
   4. العينات جاهزة الآن للتحليل بواسطة RP-HPLC.
   فئة

   6. قياسات HPLC للبيورينات

   1. حدد الزر "تشغيل العينات" ؛ اختر "طريقة مجموعة عينة جديدة" من قائمة "ملف".
   2. حدد خيار "فارغ" وأشر: رقم القارورة (في جهاز أخذ العينات التلقائي) ، واسم العينة ، وحجم الحقن (50 ميكرولتر).
   3. حدد طريقة عمود التوازن وطريقة نموذج التشغيل الموضحة في الجدول 1 والجدول 2 ، على التوالي ، لجميع عمليات التشغيل الفارغة والنموذجية التالية.
      ملاحظه: قم بتعيين طريقة عمود التوازن (الجدول 1) قبل كل تشغيل عينة.
   4. حقن 50 ميكرولتر من الفراغ (وسط خال من المصل) ومن كل عينة.
   5. حدد تركيز البيورينات في كل عينة ، وحدد كمية AMP و ADO و INO من خلال الحصول على مناطق الذروة في أوقات الاستبقاء الموضحة في الجدول 3.
      1. حدد زر "عملية" وبعد ذلك خيار "تكامل". بدلا من ذلك ، اختر يدويا نقطتي البداية والنهاية لكل ذروة واحدة للحصول على قياس المساحة. يتم ذلك عن طريق تتبع الخط بين نقطتي البداية والنهاية للذروة.
      2. حدد تركيز الميكرومتر بتطبيق المعادلة التي تم الحصول عليها للمنحنى القياسي: y = mx + b ، حيث يمثل x تركيز μM و y هي مساحة الذروة المقاسة من العينة المجهولة.
         ملاحظة: تم الإبلاغ عن مثال على منحنى معايرة ADO القياسي في الشكل 1 ، حيث: x = (y area - 981.02) / 40026
   6. بالنظر إلى أنه تم تعليق 2 × 10⁶ خلايا في 0.500 مل من الوسط ، احسب ميكرومول AMP و ADO و INO المستهلكة و / أو المنتجة بواسطة 10⁶ خلايا CLL باستخدام النسبة التالية:
      ميكرومول: 1,000 مل = x ميكرومول: 0.250 مل
      ملاحظه: الميكرومول في 1,000 مل (عدد الميكرومول في 1 لتر) من تعادل تركيز ميكرومولار و x هي ميكرومول من النيوكليوتيدات أو النيوكليوزيد التي تنتجها 10⁶ خلايا. أخيرا ، قم بتحويل الميكرومول إلى nmoles مستهلكة و / أو تنتجها 10⁶ خلايا CLL: nmoles = μmoles x 1,000

النتائج

الشكل 1.توليد منحنى قياسي داخلي.منحنى معيار المعايرة التمثيلي ل ADO والمعادلة النسبية التي تم الحصول عليها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات AIM V مصل متوسط خال من السيروم جيبكو 12055-091 سائل (درجة بحثية) الأدينوزين 5'-أحادي الفتات (AMP) سيجما ألدريتش أ 1752 الأدينوزين (ADO) سيجما ألدريتش أ 9251 الإينوزين (INO) سيجما ألدريتش ط 4125 أسيتونيتريل (CHROMASOLV Plus) سيجما ألدريتش 34998 HPLC الصف أسيتات الأمونيوم سيجما ألدريتش 9688 7 ملي مولار ، درجة الحموضة 3.0 قوارير الخيط القصير VWR 548-0029 1.5 مل / كوب إدراج دقيق VWR 548-0006 0.1 مل / كوب أغطية المسمار VWR 548-0085 9 مم / PP أزرق عمود أتلانتس dC18 المياه 186001344 5 ميكرومتر، 4.6 مم × 150 مم عمود الحراسة Atlantis dC18 المياه 186001323 5 ميكرومتر ، 4.6 مم × 20 مم وحدة فواصل تحالف Waters Alliance 2965 المياه وحدة فصل HPLC كاشف مصفوفة الثنائي الضوئي Waters 2998 (PDA) المياه كاشف الأشعة فوق البنفسجية برنامج Waters Empower2 المياه