Microdissection من الأنسجة الجنينية العين اسماك الزرد

ملخص

توضح هذه المقالة نهج لشبكية العين microdissect الزرد مع وبدون صباغ الشبكية ظهارة المرفقة ، 1-3 أجنة postfertilization يوما.

الملخص

الزرد هو نموذج حيواني شعبية للبحث حول التنمية بسبب العين السريعة لها

البروتوكول

الجزء 1 : التحضيرات قبل microdissection

1. الحلول
   1. E3 المتوسطة ⁴ (5 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي بوكل ، 0.33 ملي CaCl ₂ و 0.33 ملي MgSO _4).
   2. حل رينغر ^{1 ، 5} (116 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 2.9 ملي بوكل ، 1.8 ملي CaCl ₂ ، 5 HEPES مم ، pH7.2) ، تصفية تعقيمها.
   3. 5N هيدروكسيد الصوديوم.
2. النقش الكيماوية من الإبر التنغستن
   1. آمن كوب صغير يحتوي 5N هيدروكسيد الصوديوم على طبق بيتري بواسطة الطين.
   2. إرفاق مشبك الورق إلى جانب الكأس ، بحيث يأتي في اتصال مع محلول هيدروكسيد الصوديوم.
   3. توصيل القطب السالب من العاصمة امدادات الطاقة الى مشبك الورق والقطب الموجب إلى واحدة من نهاية قطعة قصيرة (~ 2cm) من سلك التنجستن.
   4. التفاف على الطرف الآخر من سلك التنغستن مع كرة صغيرة من الطين وتراجع هذه الغاية في محلول هيدروكسيد الصوديوم.
   5. زيادة الجهد ل3V تقريبا وتراجع السلك صعودا وهبوطا في محلول هيدروكسيد الصوديوم حتى يتم التوصل إلى سعر النقش جيدة. يمكن عادة إبرة في نوعية جيدة يكون محفورا في 10 دقيقة.
   6. وسلك التنغستن عرضة لتصبح أرق حل تدريجيا. عندما يسقط الكرة من الطين ، فإن الجانب الآخر من الأسلاك التي لا تزال تعلق على القطب الموجب لها شكل إبرة حادة.
   7. شطف إبرة حادة مع حل رينغر E3 أو لإزالة رواسب الملح.
   8. إرفاق الإبرة إلى قضيب خشبي بواسطة الشريط أو حامل إبرة لسهولة التعامل.
3. الثقافة لوحات
   1. وفالكون 60 مم X البوليسترين لوحات ثقافة 15 جاهزة للاستخدام لmicrodissection الشبكية.
   2. لتشريح RPE المرفقة شبكية العين ، سحق two أجنة تماما في لوحة الثقافة التي تحتوي على حل رينغر للتخلص من صوقية من السطح قبل 30 دقيقة من تشريح. قبل وقت قصير من التشريح ، وغسل لوحة على نطاق واسع مع الحل رينغر الطازج.
4. أجنة جمع والتدريج
   1. تمسك الزرد الكبار كما هو موضح ^{4 ، 5.}
   2. فصل الأسماك في أحواض تربية الوالدين ثابتة البشرى بواسطة مقسم ليلة قبل التزاوج.
   3. إزالة الفاصل بعد تشغيل الضوء على غرفة في صباح اليوم التالي. تسمح للوالدين لعبور 10 دقيقة في فترات كل نصف ساعة. فصل الأسماك بعد كل معبر.
   4. الحفاظ على الأجنة التي تم جمعها من كل عبور في E3 المتوسطة بشكل منفصل في 28 درجة مئوية.
   5. الأجنة في مرحلة 10-12 التسميد آخر ساعة (HPF) وعلى الفور restage قبل التشريح في نقطة زمنية محددة ، وفقا للمعايير المقررة ^{1 ، 6.}

الجزء 2 : تشريح -- إزالة المخ والتعرض العين ¹

• الإجراءات المذكورة في هذا المقطع هي مشتركة لتشريح شبكية العين (الجزء 3A) وRPE المرفقة شبكية العين (الجزء 3B).
• تتم جميع تشريح غرامة من قبل غيض من ملقط دومون ويعاونه زوج آخر من ملقط دومون لتحديد المواقع الأنسجة. ويمكن استخدام إبرة التنجستن كيميائيا محفورا عن التلاعب أدق إذا لزم الأمر.
• يتم تنفيذ كافة تشريح غرامة على التكبير ~ 5 - 8X تحت المجهر SZX16 أوليمبوس مجهزة هدفا 1X أو ما يعادلها.
• الحفاظ على الأجنة في E3 المتوسطة في مقعد الحاضنة الأولى في 28 درجة مئوية بجانب المجهر للوصول السهل الجنين أثناء تشريح.
• وتحسنت المرحلة المجهر إلى 28 درجة مئوية بحلول لوحة الحرارية للحد من تأثير تقلبات درجة الحرارة على التعبير الجيني.

1. أعد نقل الجنين في مرحلة تطويرية معينة إلى حل رينغر في 60 X 15 مم فالكون لوحة الثقافة كما هو موضح في الجزء 1 # 3.
2. قطع الرأس مع جزء من الجذع الأمامي بسرعة من الجسم.
3. دبوس نهاية الخلفي من هذا النسيج على لوحة الثقافة مع ملقط مساعدة.
4. فتح الرأس على الجانب الظهري بدءا من الجبهة الأمامية.
5. إزالة المخ بحيث يتعرض الجانب الإنسي للعيون وتواجه التصاعدي لمزيد من التلاعب.

3A الجزء : ¹ تشريح الشبكية

1. تحضير الجنين كما هو موضح في الجزء 2.
2. فرشاة بعناية RPE تعرض على الجانب الإنسي للكرة العين التي تواجه صعودا من قبل غيض من الملقط حتى ينظر إلى فتحة صغيرة في شبكية العين.
3. الاستمرار في تنظيف وتقشير العمل حتى في الجانب الإنسي للشبكية يكاد يتعرض جميع. تجنب خدش واللكم على شبكية العين تتعرض لها.
4. لإزالة RPE الوحشي على الشبكية التي تواجه الآن نحو الانخفاض ، والنهج الذي الفرشاة بزاوية 45 درجة تقريبا من سطح لوحة الثقافة.
5. إزالة RPE التي ترتبط بقوة نسبيا في مشرشر ORA التي تعلق جزء من فصل إلى RPE جلوحة ulture التشريح ، ومن ثم رفع شبكية العين برفق.
6. لفة الشبكية في الجزء السفلي من الطبق الثقافة لتنظيف RPE المتبقية.
   1. لاحظنا أن هذا البوليسترين فالكون لوحة خاصة لديه ثقافة الالتزام التفضيلية للRPE لحوالي 20 دقيقة مرة واحدة سحقت جنين. وتستخدم هذه الخاصية لإزالة مخلفات RPE. ومع ذلك ، فإن خلايا الشبكية لا عصا على السطح إلى حد أقل ، والتي يمكن تفتيشها بشكل وثيق تحت التكبير عالية. على المرء أن توازن بين اكتمال إزالة RPE والنزاهة في شبكية العين.
   2. العدسة تتمسك كثير من الأحيان إلى لوحة الثقافة ويفصل من شبكية العين خلال عملية المتداول. أحيانا ، فمن الضروري فصل العدسة عن طريق إبرة التنغستن محفورا مع دوامات العمل على سطح العدسة.
7. ويمكن إزالة هذه الإجراءات بنجاح RPE من الشبكية دون المساومة على سلامة الأنسجة. ويدل على هذا التشكل شامل جيدة (الشكل 1B و "B) والأنسجة (الشكل 1B") ، السهم وعلى وجه الخصوص ، والحفاظ على المصفوفة خارج الخلية في مبصرة بين طبقة وRPE هو جيد بشكل استثنائي (1B الشكل "؛ مقارنة مع الأنسجة من الجنين كله (الشكل 1A ")).

3B الجزء : RPE المرفقة تشريح الشبكية ³

1. تحضير الجنين كما هو موضح في الجزء 2.
2. رأس دبوس إلى لوحة الثقافة التي ملقط مساعد. رفع العين بلطف من الجانب الخلفي والجانبي لفة على الجانب الأمامي.
   1. ويعلق المشيمية الظنية والأنسجة الصلبة على السطح الخارجي للطبقة RPE نسبيا بإحكام على الجلد ، ويمكن مقشر معظمها من قبل المتداول خارج العين بعناية إلى الجانب الأمامي.
3. إزالة العدسة بإبرة التنغستن بعد تعرض الجانب الوحشي من العين ، وعندما لا تزال تعلق على العين على الجلد.
4. يمكن لهذه الإجراءات المحافظة على طبقة RPE بنجاح كامل مع شبكية العين. يمكن choroids الافتراضي وإزالة الأنسجة الصلبة إلى حد كبير (الشكل 1C ، 'C و C").

الجزء 4 : الأنسجة جمع العينات لعمل الحمض النووي الريبي

1. ويمكن جمع عينات تشريح في TRIzol في أنبوب microfuge ريبونوكلياز خالية من الحمض النووي الريبي لتوصيف المصب صفه قبل ^1.

ممثل النتائج

الشكل 1 (أ) والجانبي (A ') عرض الظهرية من رأس اليرقات الزرد في 52 HPF قبل تشريح. (A ") والفرع المقابل النسيجي للرئيس اليرقات في الفقرة (أ) و (A') ، (ب) والجانبي (B ') عرض الظهرية لتشريح شبكية العين في 54 HPF. سطح الشبكية كان سليما من كل الاطراف وجهات النظر الظهرية (B ") والفرع المقابل النسيجي للتشريح في شبكية العين (ب) و (B'). وكان هيكل في شبكية العين وتصفيح الشبكية سليمة. على وجه الخصوص ، "كانت محفوظة بشكل جيد (والسهام في شبكية العين تشريح (B المصفوفة خارج الخلية بين طبقة مبصرة وRPE A)" والسهام). (C) والجانبي (C ') عرض الإنسية لشبكية العين RPE المرفقة تشريح في 52 HPF. وكان RPE طبقة سليمة ومستمرة ، وهو ما تدل أيضا المقطع النسيجي للتشريح الأنسجة (C "). وتبلغ مساحة بيضاء في' C هو العصب البصري (السهم) للحصول على الأنسجة ، تم جمع عينات من الأنسجة وإصلاحها في 4 ٪ أجريت بارافورمالدهيد. بلاستيك وsectioning تضمين هذه العينات كما هو موضح ^3. شريط مقياس = 50 ميكرومتر.

المناقشة

ويمكن للأنسجة العين Microdissection الزرد الحصول على شبكية العين سليمة وفعالة شبكية العين RPE المرفقة. هذا يساعد كثيرا الدراسات المتعلقة التعبير نسيج العين محددة (شبكية العين أو أي RPE). في الواقع ، لقد نجحنا في استغلال هذه الإجراءات للحصول على الحمض النووي الريبي ملامح التعبير في شبكية العين كله ¹ و ³ RPE. ويؤيد بشدة فائدة هذه التشكيلات التي لدينا تبين مؤخرا من المسارات والأسر الجينات التي تضطرب في تمايز الشبكية متحولة ^2. الخطوات الأكثر أهمية في إ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
محرك مدقة لاسلكي	VWR international	47747-370
مزود طاقة تيار مستمر	لاسكار	PSU130	سيكون أي مصدر تيار مستمر مناسباً، ولكن سيتطلب الجهد المحدد لجهاز مختلف مزيداً من التحسين.
مدقة تستخدم لمرة واحدة &أنبوب دقيق، 1.5 مل (خالٍ من الـ DNase والـ RNase والمواد المسببة للحمى)	VWR international	47747-366	تُستخدم هذه الأدوات لجمع الأنسجة في TRIzol بغرض تحليل التعبير الجيني.
ملقط Dumont #5، الرؤوس: 0.05 × 0.01 مم، Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	يُفضل أن يكون بُعد السن دقيقاً، ولكن هذا الأمر ليس إلزامياً، إذ قد يحتاج المرء إلى شحذ السن من حين لآخر.
ملقط Dumont #5SF، الرؤوس: 0.025 × 0.005 ملم، Inox	Fine Science Tools	11252-00	يُفضل أن يكون بُعد السن دقيقاً، ولكن هذا ليس شرطاً صارماً، إذ قد يتطلب الأمر شحذ السن من حين لآخر.
أطباق زراعة من البوليسترين ماركة Falcon، 60 × 15 مم	BD Biosciences	351007	تُستخدم هذه الأطباق كأطباق للتشريح.
المجهر الستيريوسكوبي Olympus SZX16	Olympus Corporation	SZX16	يمكن استخدام أي مجهر ستيريوسكوبي (مجسم). وقد استخدمنا المجهر الستيريوسكوبي من شركة Leica في دراسات سابقة.1-3 دون حدوث أي مشكلات. كما أننا نستخدم الشيئية ذات التكبير 1X حصرياً لعملية التشريح، على الرغم من وجود شيئية ذات تكبير 2X مثبتة.
حجر شحذ	Fine Science Tools	29008-01	استخدم هذا لشحذ طرف الملقط إذا لزم الأمر
لوحة تسخين	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	يُستخدم هذا للحفاظ على درجة حرارة النسيج طوال عملية التشريح، وللحد من تأثير تقلبات درجات الحرارة على التعبير الجيني. كما أننا نضع المجهر بالكامل في غرفة ذات بيئة محكومة عند درجة حرارة 28.°سي أثناء التشريح في الدراسات السابقة1-3 بنجاح تام.
Trizol، ١٠٠ مل	Invitrogen	15596-026
سلك تنجستن، بقطر 0.015 بوصة	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
مطبق خشبي	بيوريتان	807	يُستخدم هذا لتثبيت إبرة التنجستن المحفورة كيميائيًا.