مقالة منهجية

عزل خلايا T-ALL ذات العلامات الفلورية: طريقة لعزل خلايا T-ALL من أسماك الزرد البالغة

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Pruitt، M.M.، et al. عزل السكان الجانبيين في سرطان الدم الليمفاوي الحاد الناجم عن الخلايا التائية في أسماك الزرد.

يصف هذا البروتوكول تقنية عزل الخلايا السرطانية لسرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية (T-ALL) المسمى بالفلورسنت من سمكة الزرد البالغة وقياسها باستخدام صبغة التريبان الزرقاء.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. مجموعة من خلايا T-ALL المصنفة فلورسنت من أسماك الورم الأولية

  1. تحضير 20 مل على الأقل من مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة بنسبة 10٪ في محلول ملحي مخزن بمقدار 0.9x فوسفات (FBS/PBS).
  2. أضف 1 مل من FBS / PBS إلى قارورة واحدة من ملح الصوديوم الهيبارين (300 وحدة).
  3. اختر الأسماك التي تحمل أورام في أكثر من 50٪ من الجسم ، أو تلك الأسماك التي تواجه صعوبة في الأكل أو السباحة. ضحي بالسمك عن طريق جرعتها الزائدة من التريكيين أو غمر الماء المثلج. تأكيد الموت بسبب قلة حركة الخياشيم ونبضات القلب.
  4. استخدم شفرة حلاقة لإزالة رأس السمكة.
  5. اغسل تجويف السمك بمحلول الهيبارين لإزالة خلايا الدم الحمراء الزائدة.
    1. باستخدام ماصة، قم بحقن 100 ميكرولتر من محلول الهيبارين (أضف 1 مل من FBS/PBS إلى قارورة واحدة من ملح الهيبارين الصوديوم) في تجويف جسم السمكة. قم بإزالة كل السوائل التي تنسكب (ستحتوي على خلايا الدم) وقم بتثبيتها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    2. استخدم طرف ماصة جديد لغسل الجسم مرة أخرى. قم بإجراء ثلاث غسلات على الأقل ، أو حتى يبدو السائل الذي ينسكب خاليا من الدم.
    3. تخلص من كل السوائل من الغسالات في هذه الخطوات ، حيث لن يتم استخدامها في مزيد من التحليلات.
  6. اجمع خلايا ابيضاض الدم.
    1. حقن 100 ميكرولتر من FBS / PBS في تجويف جسم الأسماك.
    2. ضع ضغطا برفق على الجزء الخارجي من جسم السمكة باستخدام طرف الماصة للضغط / دفع الخلايا السرطانية.
      ملاحظه: إذا تم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجهر تشريح ، فستكون الخلايا السرطانية المنسكبة من تجويف الجسم واضحة.
    3. اجمع السائل والخلايا من كل غسلة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    4. كرر الخطوات 1.6.1-1.6.3 حتى يتم جمع معظم الخلايا السرطانية (عادة 5-10 مرات). اجمع جميع الخلايا السرطانية في نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. احتفظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة.
  7. امزج الخلايا السرطانية التي تم جمعها من الخطوة السابقة عن طريق ماصتها برفق لفصل كتل الخلايا. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مرشح شبكي 40 ميكرومتر. اغسل الفلتر 1-2 مرات باستخدام 100 ميكرولتر من FBS / PBS. احتفظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة.
  8. امزج 2 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 18 ميكرولتر من التريبان الأزرق (0.4٪ ، مخفف بنسبة 1:10 ومفلتر) في أنبوب جديد. قم بتحميل 10 ميكرولتر على مقياس كثافة الدم واحسب عدد الخلايا الفلورية الحية (غير الزرقاء) لحساب عدد الخلايا السرطانية المعزولة.
    ملاحظه: من المحتمل أن تكون الخلايا غير الزرقاء سلبية GFP خلايا تائية طبيعية وغير خبيثة ولا ينبغي حسابها. مطلوب ما لا يقل عن 2 × 106 خلايا لتلطيخ الخلايا باستخدام Hoechst 33342.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سمك الزرد المتزاوي (CG2) انظر Mizgireuv et al., 2006 rag2: بلازميد C-MYC مختبر لانجيناو rag2: بلازميد GFP تم إنشاؤه في مختبر دي جونغ مروج rag2 من مختبر Langenau pCS2-transposase البلازميد مختبر شين مجهر SteREO Discovery V8 الفحص المجهري لكارل زايس هاتف: 495015-0008-000 تريكايين ميثان سولفونات (MS-222) شركة ويسترن كيميكال فيشر ساينتفيك - NC0342409 100 جرام مصل الأبقار الجنينية (FBS) مختبرات HyClone، Inc. فيشر ساينتفيك - SH3007103 500 مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) جيبكو من لايف تكنولوجيز 1001-023 الرقم الهيدروجيني 7.4 (1x) - 500 مل ملح الصوديوم الهيبارين سيجما ألدريتش 2106 15 - 300 قارورة وحدة مرشح شبكي 40 ميكرومتر ماركة فالكون كورنينج هاتف: 352340 حالة من 50 تريبان بلو سيجما لايف ساينس تي 8154 20 مل - محلول (0.4٪)

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FBS PBS GFP

مقالات ذات صلة