مقالة منهجية

فحص السكان الجانبيين: طريقة لعزل السكان الجانبيين للخلايا السرطانية من أسماك الزرد

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Pruitt، M.M.، et al. عزل السكان الجانبيين في سرطان الدم الليمفاوي الحاد الناجم عن الخلايا التائية في أسماك الزرد.

يصف البروتوكول التالي طريقة لعزل السكان الجانبيين للخلايا السرطانية لسرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية (T-ALL) ، والتي تتكون من خلايا جذعية ، من سمكة الزرد البالغة. تفتقر المجموعة الجانبية إلى علامات الخلايا البارزة ، وبالتالي نستخدم مقايسة تدفق الصبغة Hoechst 33342 لعزلها.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تلطيخ خلايا T-ALL المسماة بالفلورسنت باستخدام Hoechst 33342 لتحديد السكان الجانبيين

  1. تمييع Hoechst 33342 1:10 مع H2O خال من النوكلياز لجعل تركيز العمل 1 مجم / مل. قم بتخزين الصبغة في درجة حرارة 4 درجات مئوية وفي الظلام.
  2. تحضير محلول 100 ملي مولار من الفيراباميل عن طريق إذابة 49.1 مجم في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    ملاحظه: فيراباميل هو مثبط لناقلات ABC وهو عنصر تحكم مهم في تجارب السكان الجانبية. ستؤدي إضافة الفيراباميل إلى العينات إلى تثبيط قدرة ناقلات ABC على تدفق صبغة Hoechst 33342. لذلك ، ستختفي مجموعة جانبية حقيقية عند إضافة فيراباميل إلى العينة.
  3. اضبط الحمام المائي على 28 درجة مئوية.
  4. قم بإعداد العينات والضوابط في الظلام عن طريق إضافة خلايا ومحاليل إلى أنابيب فارز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS).
    1. قم بإعداد العينات عن طريق إضافة 106 خلايا ، و 15 ميكرولتر من 1 مجم / مل Hoechst 33342 ، و 2.5 ميكرولتر من DMSO إلى أنبوب FACS. اضبط مستوى الصوت على 1 مل باستخدام FBS / PBS.
    2. قم بإعداد عناصر التحكم عن طريق إضافة 106 خلايا ، و 15 ميكرولتر من 1 مجم / مل Hoechst 33342 ، و 2.5 ميكرولتر من 100 ملي مولار فيراباميل إلى أنبوب FACS. اضبط مستوى الصوت على 1 مل باستخدام FBS / PBS.
      ملاحظه: يوصى بما لا يقل عن 106 خلايا / عينة ، ولكن يفضل تلطيخ المزيد من الخلايا ، خاصة إذا تم فرز الخلايا الجانبية لمزيد من التحليل. لا تتجاوز 106 خلايا / مل ، وحافظ على تركيز Hoechst 33342 عند 15 ميكروغرام / مل. إذا تم تلطيخ 10 × 106 خلايا ، فإن إجمالي حجم التفاعل هو 10 مل.
  5. احتضن في حمام مائي 28 درجة مئوية في الظلام لمدة 120 دقيقة.
  6. بعد الحضانة ، ضع الخلايا على الفور على الجليد واحتفظ بها في الظلام.
  7. حبيبات الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 6 دقائق عند 300 × جم. قم بإزالة المادة الطافية. يغسل ب 1 مل من FBS / PBS.
  8. حبيبات الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 6 دقائق عند 300 × جم. قم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من FBS / PBS.
  9. يحفظ في 4 درجات مئوية حتى فرز الخلايا.
  10. قبل 15 دقيقة من فرز الخلايا ، أضف 2 ميكرولتر من مخزون يوديد البروبيديوم (PI) (1 مجم / مل) إلى كل 1 مل من FBS / PBS (التركيز النهائي: 2 ميكروغرام / مل). اخلط جيدا.
< p class = "jove_title" >2. استخدم FACS للعثور على المجموعة الجانبية داخل مجموعة خلايا T-ALL المسماة بالفلورسنت

  1. قم بتحليل معلقات خلايا الزرد الملون T-ALL على فارز الخلايا المجهز بليزر الأشعة فوق البنفسجية لإثارة صبغة Hoechst 33342 وليزر 488 نانومتر لإثارة PI وللكشف عن خلايا GFP + T-ALL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصل الأبقار الجنينية (FBS) مختبرات HyClone، Inc. فيشر ساينتفيك - SH3007103 500 مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) جيبكو من لايف تكنولوجيز 1001-023 الرقم الهيدروجيني 7.4 (1x) - 500 مل هوشت: 33342 تقنيات الحياة H3570 10 مل فيراباميل سيجما لايف ساينس V4629 1 جرام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيجما لايف ساينس د8418 100 مل بروبيديوم يوديد تقنيات الحياة ص 3566 10 مل فارز الخلايا الانصهارية FACSAria BD Biosciences

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ABC

مقالات ذات صلة