تحفيز الخلايا التائية خارج الجسم الحي في ورم البنكرياس: طريقة لزيادة إنتاج السيتوكين في الخلايا التائية

الملخص

المصدر: Spear, S., et al. جيل أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف السمية الخلوية للخلايا التائية المتطفلة للورم. J. Vis. Exp. (2019).

توضح هذه المقالة تقنية تحفيز الخلايا التائية خارج الجسم الحي لزيادة التركيز داخل الخلايا للسيتوكينات مثل الإنترفيرون جاما أو IFN-gamma وعامل نخر الورم ألفا أو عامل نخر الورم ألفا أو عامل نخر الورم ألفا في الخلية التائية. تتوسط هذه السيتوكينات استجابة فعالة مضادة للورم ويمكن أن يكون لها دور علاجي في الورم.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. هضم أورام البنكرياس

1. ضع ورم البنكرياس المفصل أو أورام الموقع النقيلي أو أنسجة البنكرياس السليمة في PBS المثلج ، واحفظه على الثلج.
   1. استخدم الملقط لنقل الورم إلى طبق بتري.
   2. أضف 5.0 مل من وسط الهضم (2 مجم / مل كولاجيناز ، 0.025 مجم / مل DNase RPMI) في أنبوب سعة 50 مل ؛ تخزينه على الثلج لمنع بدء نشاط الإنزيم.
      ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول الكولاجيناز من النوع الخامس ، والذي يحتوي على نشاط يبلغ ≥1 وحدة / مجم FALGPA و > 125 وحدة هضم كولاجين (CDU) / ملغ صلب. يمكن تخزين الكولاجيناز و DNase عند -20 درجة مئوية وإذابتها على الجليد قبل الاستخدام. عندما يتم إذابة كلاهما تماما في RPMI معقم ، يمكن تمريرهما عبر مرشح 0.2 ميكرومتر لإزالة الملوثات. يجب إذابة الكولاجيناز تماما قبل الترشيح لتجنب فقدان المواد.
   3. خذ كمية صغيرة من هذا المحلول لتغطية الورم على طبق بتري.
   4. استخدم مشرطا معقما وملقطا لتقطيع الورم إلى قطع صغيرة يقل طولها عن 3 مم تقريبا.
   5. اكشط قطع الورم في الأنبوب واقلب الأنبوب برفق حتى تغمر جميع القطع في وسط الهضم. يحفظ على الثلج إذا كانت هناك حاجة إلى تحضير عينات أخرى من الورم دفعة واحدة.
   6. انقله إلى جهاز الاهتزاز لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تأكد من أن جميع قطع الورم مغمورة وليست ملتصقة بحافة الأنبوب. إذا لم يكن الاهتزاز ممكنا ، فقم بتدوير العينة كل 5 دقائق للمساعدة في الهضم.

< p class = "jove_title" >2. تحضير معلق خلية واحدة من الورم المهضوم

1. مباشرة بعد خطوة الهضم ، ضع الأنبوب على الجليد لإبطاء نشاط الإنزيم.
   1. أضف EDTA لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 20 ملي مولار وقم بخلط عينة دوامة لفترة وجيزة. سيؤدي ذلك إلى إبطاء نشاط الإنزيم.
   2. افتح الأنبوب واشطف أي هضم ورم من غطاء الأنبوب بوسط RPMI جديد.
   3. قم بإعداد مصفاة 70 ميكرومتر (يمكن تغيير حجم المصفاة حسب الرغبة) على أنبوب مفتوح سعة 50 مل ، على الثلج.
   4. بلل الفلتر مسبقا بمتوسط.
   5. أعد تعليق الخلايا المهضومة واغسل جوانب الأنبوب باستخدام شريط سعة 25 مل أو أكبر. الفتحة الأوسع للشريط مهمة للسماح للهضم السميك بالمرور بسهولة.
   6. انقل كل الملخص باستخدام شريط سعة 25 مل إلى المصفاة.
   7. اهرسي الورم أعلى الفلتر باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل. اهرسها مباشرة لأعلى ولأسفل لتقليل إجهاد القص للخلايا.
   8. اغسل الخلايا باستمرار من خلال المصفاة باستخدام RPMI. تأكد من الغسيل بقوة كافية لدفع الخلايا من خلالها.
   9. إذا كانت لا تزال هناك مادة للهرس ، لكن RPMI يتوقف عن التدفق ، فستكون المصفاة مشبعة. لذلك ، انقل العينة إلى مرشح جديد وتابع.
      ملاحظه: في النهاية ، ستبقى مكونات المصفوفة خارج الخلية فقط في المرشح ، ويجب أن تكون جميع الخلايا المفردة قد مرت من خلالها.
2. جهاز الطرد المركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4 درجات مئوية.
   1. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية في RPMI كامل وقم بالمرور مباشرة عبر مرشح آخر لإزالة أي مصفوفة خارج الخلية أو كتل خلايا كبيرة لا يمكن إعادة تعليقها بشكل كاف.
   2. في هذه المرحلة ، إذا لم تكن هناك حاجة إلى تحفيز ، فقم بتلطيخ الخلايا المعزولة على الفور لتحليل قياس التدفق الخلوي عن طريق تخطي الطرد المركزي للوحة لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق تحريك اللوحة رأسا على عقب في حركة حادة واحدة. بدلا من ذلك ، قم بتعليقها في وسط التجميد (10٪ DMSO في FBS) وتخزينها عند -80 درجة مئوية متبوعا بتخزين طويل الأجل في النيتروجين السائل.
      ملاحظه: يمكن أن تسمح خطوة التجميد بتنقية الخلايا المناعية في وقت لاحق. ومع ذلك ، قد يتطلب القياس الكمي للمجموعات الفرعية للخلايا المناعية تحسينا للتأكد من أن أعداد الخلايا والنمط الظاهري لا يتأثران بعملية التجميد / الذوبان. من الأفضل إجراء تحفيز الخلايا التائية خارج الجسم الحي على عينات الورم الطازجة. في هذه المرحلة ، يمكن تنقية العينة بشكل أكبر عن طريق إزالة الخلايا الميتة القائمة على الخرزة أو فحوصات تخصيب الخلايا المناعية إذا لزم الأمر.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الخلايا للتحفيز خارج الجسم الحي

1. عد الخلايا لتحقيق تركيز 2 × 10⁶/100 ميكرولتر في وسط كامل (RPMI 10٪ FBS ، 1X بنسلين و 1X ستربتومايسين).
   ملاحظه: يضمن العدد الكبير من إجمالي الخلايا المطلية أنه سيكون هناك خلايا تائية كافية داخل هذه العينة لتحليلها. ومع ذلك ، يمكن زيادة الرقم أو تقليله اعتمادا على توافر العينة والطبيعة النادرة للمجموعات الفرعية للخلايا التائية ذات الأهمية.
   1. صفيحة 100 ميكرولتر من الخلايا في صفيحة 96 بئر ذات قاع U.
   2. أضف 100 ميكرولتر من الوسط الكامل الذي يحتوي على 2x تحضير من PMA / الأيونوميسين (لتحقيق تركيز نهائي 0.081 ميكرومتر و 1.34 ميكرومتر ، على التوالي ، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة).
      ملاحظه: في حالة قياس التحلل / إفراز الخلايا ، قم أيضا بتضمين CD107a المترافق بالفلورسنت المضاد للفأر في الوسائط. يجب أيضا إجراء عينة تحكم لا تحتوي على CD107a.
   3. ضعها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 1 ساعة.
   4. أضف 20 ميكرولتر من 10x مستحضر من brefeldin A و monensin (لتحقيق تركيز نهائي 1.06 ميكرومتر و 2.0 ميكرومتر ، على التوالي (على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) في وسائط كاملة.
      ملاحظه: Brefeldin A و monensin هي مثبطات لنقل البروتين وبالتالي تمنع إطلاق السيتوكينات خارج الخلية ، وما إلى ذلك مما يسمح باكتشافها عن طريق قياس التدفق الخلوي. إذا كان قياس إطلاق السيتوكين في المادة الطافية بواسطة ELISA أو طرق مماثلة - فيمكن تخطي هذه الخطوة.
   5. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 4 ساعات أخرى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصفاة خلية بحجم المسام 70 ميكرومتر فيشر ساينتيك 11597522 مضاد ل CD107a PE (استنساخ 1D4B) بيوليجند 121612 1:100 إلى الإعلام الثقافي ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش أ 4503 كوكتيل تحفيز الخلايا (500x) (فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) والأيونومايسين) العلوم البيولوجية الإلكترونية 00-4970-03 × التركيز النهائي PMA 0.081 ميكرومتر ، الأيونوميسين 1.34 ميكرومتر THP1 خلايا ابيضاض الدم البشرية أحادية الخلية ATCC TIB-202 الكولاجيناز النوع الخامس من المطثية النسائية سيجما ألدريتش [ك9263] [ك] 2 ملغم/مل في الوسائط ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيجما ألدريتش D2650-100 مل مخزون DNase (Deoxyribonuclease I من البنكرياس البقري من النوع II-S) 10 مجم / مل في 0.15 M كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش د4513 التركيز النهائي في وسائط الهضم 0.025 مجم / مل مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية أ 15-104 10٪ في RPMI سلسلة حقنة هاميلتون 700 ، حجم 25 ميكرولتر ، طرف شطبة إبرة قياس 22 ثانية فيشر ساينتيك 10100332 البنسلين / الستربتومايسين جمعية المحاسبين الفلسطينيين 15140122 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين كوكتيل مثبط نقل البروتين (500x) (بريفيلدين أ ومونيسين) العلوم البيولوجية الإلكترونية 00-4980-03 1x التركيز النهائي Brefeldin A 10.6 ميكرومتر ، مونينسين 2 ميكرومتر RPMI-1640 (يحتوي على 0.3 جم/لتر من الجلوتامين) سيجما ألدريتش R8758 شفرة مشرط جراحية رقم 10 سوان مورتون 501 ريال محلول التربسين EDTA 10x سيجما ألدريتش 594-18 ج التربسين (0.1٪) EDTA (0.4٪) التركيز النهائي لوحة ميكروويل 96 ذات قاع U VWR 734-2080