فحص المرونة العصبية البنكرياسية في المختبر: دراسة التغيرات في الخلايا العصبية في الجهاز الهضمي المعرضة لمستخلصات أنسجة البنكرياس البشرية الصحية والسرطانية

الملخص

المصدر: Demir, I. E., et al. محاكاة المرونة العصبية للبنكرياس: فحص اللدونة العصبية المزدوجة في المختبر . J. Vis. Exp. (2014).

يوضح هذا الفيديو في المختبر اختبار المرونة العصبية لدراسة التغيرات المورفولوجية في العقد الجذرية الظهرية والخلايا العصبية للضفيرة العضعية المعوية المعرضة لمستخلصات أنسجة البنكرياس البشرية السليمة والسرطانية. يسمح لنا هذا الاختبار بدراسة نمو الخلايا العصبية والنمط المتفرع وحجم الخلايا العصبية.

البروتوكول

1. عزل الخلايا العصبية

بمجرد الانتهاء من جمع المستخلص / المواد الطافية ، استمر في عزل الخلايا العصبية.

1. بالنسبة للخلايا العصبية DRG ، اجمع DRG من عنق الرحم إلى أسفل الظهر للفئران حديثي الولادة بين يوم ما بعد الولادة (P) 2-12 بعد قطع الرأس والتشريح المجهري الفراغي ل DRG (الشكل 1 أ) . من أجل الحصول على ما يكفي من الخلايا العصبية DRG للوحة 24 بئرا ، اجمع كل DRG من عنق الرحم إلى أسفل الظهر لفأر حديث الولادة (أي ما يعادل 52 DRG) لكل لوحة.
2. قم بقطع الإسقاطات الطرفية (العصبية) والمركزية (الجذور) ل DRG عن طريق المقص المجهري. يؤدي ترك الإسقاطات في مكانها إلى إعاقة التجربة ويزيد من خطر تلوث الزراعة بواسطة الخلايا الليفية.
3. بالنسبة للخلايا العصبية MP ، قم بقطع المساريق من الأمعاء الدقيقة وقم بتجريد الطبقة العضلية المصلية من الأمعاء الدقيقة يدويا وبعناية (للحصول على بروتوكول مفصل حول عزل MP ، الشكل 1 ب ). بالنسبة للنائب ، اجمع الضفيرة من فأرين لكل 24 لوحة بئر.
   ملاحظة: حاول أن تكون لطيفا قدر الإمكان لتجنب تمزق الطبقة المصلية العضلية لأنها تعيق انفصالها الناجح عن الأمعاء الدقيقة.
4. اجمع DRG والطبقة المصلية العضلية في وسط أساسي مثلج (MEM) مزود بجنتاميسين (20 مجم في وسط 500 مل) وميترونيدازول (2.5 مجم في وسط 500 مل).
5. بعد جمع DRG ، احتضنها في محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) المزود بالكولاجيناز من النوع الثاني لمدة 20-30 دقيقة. لعزل MP ، احتضن في نوع الكولاجيناز بين 1-3 ساعات ، اعتمادا على عمر (الشكل 1C) .
6. بالنسبة إلى MP ، اجمع قطع MP الشبيهة بالشبكة تحت مجهر مجسم وانقلها إلى MEM المثلج.
7. ثم قم بعمل DRG و MP من خلال المحاقن ذات القطر المتناقص.
   ملاحظة: يمكن أن يؤدي التريتوري المفرط إلى تدمير الخلايا العصبية ، ولكن أقل من الخلايا الدبقية.
8. بمجرد أن يصبح الوسط الذي يحتوي على DRG أو MP غائما ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 93.9 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من الوسط وأعد تعليقه في الوسط العصبي القاعدي (مكمل ب 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 0.5 ملي مولار L-glutamine و 2٪ B-27).
9. احسب العدد الإجمالي للخلايا ( أي الخلايا العصبية والخلايا الدبقية) عن طريق مقياس كثافة الدم.
   ملاحظة: يعتمد عدد الخلايا المطلوبة على معلمة القياس. لتقدير كثافة العصب, يحتاج المرء إلى ثقافات أكثر كثافة وبالتالي عدد أكبر من الخلايا من لقياس النمو العصبي, حجم حول قوافة النواة ونمط متفرع من الخلايا العصبية الفردية. لقياسات كثافة العصبيات ، استخدم على سبيل المثال 10,000 خلية (خلية عصبية + دبقية) / بئر أو 1,500 خلية عصبية / بئر. بالنسبة لقياس المرض على الخلايا العصبية الفردية ، يوصى باستخدام التربسين لفترة وجيزة (مدتها دقيقة واحدة) للخلايا وبذر 2500 خلية / بئر أو 400 خلية عصبية / بئر. يبلغ العائد النموذجي للخلايا التي تم الحصول عليها من فأر واحد حوالي 300,000-500,000 خلية.
10. قم بزرع الخلايا على أغطية مقاس 13 مم تم تغطيتها في الليلة السابقة وقم بتغطية الآبار بوسط عصبي قاعدي (مكمل ب 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 0.5 ملي مولار من الجلوتامين و 2٪ B-27) (الشكل 1 د) .
    ملاحظة: استخدم بولي د-ليسين (40 مجم / م ² ) أو أغطية مطلية بأورنيثين ولامينين (1 مجم / مل لكل منهما). ترتبط الخلايا ب poly-D-lysine بسرعة كبيرة ، مما يجعلها مناسبة للتجارب التي تحتاج إلى العديد من الخلايا ( أي { قياسات كثافة العصب). التعلق باللامينين أضعف إلى حد ما بشكل عام ، لكن اللامينين هو محفز قوي لنمو العصب. لذلك ، بالنسبة للقياسات على التفرع العصبي وطول العصبية ، تفضل طلاء الأورنيثين / اللامينين.
11. اسمح للخلايا بالالتصاق بالآبار طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإعداد الوسائط المكملة بالمستخلص (بتركيز نهائي / طافي يبلغ 100 ميكروغرام / مل).
12. قم بشفط وسط البذر ، وقم بإجراء غسيل اختياري لطيف للغاية باستخدام PBS ، ثم قم بببطء بسحب الوسائط المليئة بالمستخلصات / المواد الطافية (الشكل 1E) .
13. دع الخلايا تنمو لمدة 48 ساعة. استنشق الوسائط وقم بإصلاحه في 4٪ بارافورمالدهيد للتلوين المناعي (الشكل 1F) .
14. قم بإجراء تلطيخ التألق المناعي المزدوج باستخدام علامات خاصة بالخلايا العصبية ( على سبيل المثال بيتا III-tubulin) وعلامات خاصة بالخلايا الدبقية ( على سبيل المثال البروتين الحمضي الليفي الدبقي / GFAP) (الشكل 1G) .
15. لقياس التشكل ، استخدم مجهر ضوئي مقلوب مزود بكاميرا CCD مع برنامج آلي يسمح بقياس كثافة العصبات (انظر الجدول).
16. يتم قياس كثافة العصبية للثقافات العصبية على 4-5 صور مجهرية تمثيلية بتكبير 200x من 4 مناطق مختلفة من النمو الأكثر كثافة في كل غطاء عن طريق تراكب شبكة 50 ميكرومتر × 50 ميكرومتر وحساب كثافة الألياف لكل مربع مقاسة في الألياف المتقاطعة. يمكن قياس نمو العصبة ، ومتوسط عدد الفروع لكل خلية عصبية ، ومتوسط طول الفرع والحجم المحيط بقوى النواة من 30 خلية عصبية منفردة مختارة عشوائيا من كل غطاء عن طريق وضع علامة على العصبيات و perikarya (الشكل 1H) .

النتائج

الشكل 1. البروتوكول التخطيطي لاختبار في المختبر مقايسة المرونة العصبية. يستخدم الفحص الحالي العقد الجذرية الظهرية للفئران حديثي الولادة (DRG) والخلايا العصبية الضفيرة العضلية المعوية (MP) لدراسة تأثير مستخلصات أنسجة البنكرياس أو المواد الطافية الخلوية على مورفولوجيا الخلايا العصبية والدبقية. يتم جمع DRG بعد استئصال الصفيحة الفقرية الأمامية والطبقة العضلية المصلية المحتوي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بولي دي ليسين هيدروبروميد	سيجما ألدريتش	P1149
أورنيثين / لامينين	سيجما ألدريتش	P2533 / L4544
13 مم Coverslips	Merck		للاستخدام في 24 بئر
لوحة Dismembranator S	Sartorius
الأجسام المضادة للبيتا III توبولين	Millipore	MAB1637	تركيز 1: 200
الأجسام المضادة ل GFAP	DAKO	M0761	1: 400 تركيز
RIPA العازلة + مثبط			أي مورد
الوسيط العصبي	العصبي Gibco / علوم الحياة	21103-049
B-27 الملحق	Gibco / علوم الحياة	17504044	من المعروف أن جودة B-27 تعتمد على رقم الدفعة
Gentamicin / Metronidazole			أي مورد
الحد الأدنى من الوسط الأساسي	Gibco / علوم الحياة	31095-029
هانك محلول الملح المتوازن (HBSS)	جيبكو / علوم الحياة	24020133	يحسن نشاط الكولاجيناز عند احتوائه على Ca / Mg
كولاجيناز النوع الثاني	ورثينجتون الكيمياء الحيوية	CLS-2	الحصول على الكثير بنشاط لا يقل عن 200 وحدة / ملغ
Trypsin-EDTA 0.25٪	Gibco / علوم	الحياة 25200056
4٪ بارافورمالدهايد			أي مورد
AnalySIS docu برنامج	أوليمبوس

البروتياز