مقالة منهجية

مقايسة الفوسفاتيز في خلايا سرطان القولون والمستقيم: طريقة لفحص حالة فسفرة بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Huda, M. N., et al. فحص للفسفرة وربط الأنابيب الدقيقة جنبا إلى جنب مع توطين بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم. J. Vis. Exp. (2017)

يصف هذا الفيديو بروتوكولا لتقييم حالة فسفرة بروتين تاو عن طريق فحص الفوسفاتيز في خلايا سرطان القولون والمستقيم. يعمل إنزيم الفوسفاتيز على مجموعات الفوسفات الموجودة على بروتين تاو ، مما يزيد من حركة بروتين تاو على هلام SDS PAGE مقارنة بعينات بروتين تاو غير المعالجة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. فحص الفوسفاتيز

  1. عالج تحلل الخلية عندما تصل الخلايا إلى ~ 65٪ من التقاء (تقريبي باستخدام الفحص المجهري) ، وقم بإزالة الوسط المكمل MEM وإضافة MEM الخالي من المصل مع 5 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 30 ميكرومتر من الكركمين أو 25 ملي مولار و 50 ملي مولار و 100 ملي LiCl. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، بعد 24 ساعة من العلاج ، اغسل الخلايا ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) ، وكشط الخلايا باستخدام مكشطة الخلايا. انقل الخلايا المكشطة إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 4 دقائق عند 1,800 × جم عند 4 درجات مئوية للحصول على كريات الخلية. قم بتحليل الخلايا عن طريق تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الكامل RIPA عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة أثناء النقر بانتظام على الأنابيب. صوتنة العينات لفترة وجيزة. جهاز الطرد المركزي تتجانس الخلية في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة عند 22,570 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المواد الطافية إلى أنابيب أخرى مصنفة باستخدام ماصة) مع الفوسفاتيز القلوي في مخزن الفوسفاتيز القلوي.
    1. لكل من العينات الضابطة والمعالجة ، قم بإعداد عينات 20 ميكرولتر تحتوي على 20 ميكروغرام من البروتين الكلي. أضف حجم محللات الخلية التي تحتوي على 20 ميكروغرام من البروتين الكلي ، متبوعا بمحلول الفوسفاتيز القلوي 2 ميكرولتر و 10 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي. أضف الماء المقطر لتكوين 20 ميكرولتر.
  2. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. أوقف التفاعل عن طريق إضافة حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) بتركيز نهائي قدره 50 ملي مولار ، أو بإضافة أورثوفانادات الصوديوم (Na3VO4) بتركيز نهائي قدره 10 ملي مولار. يمكن أيضا إيقاف التفاعل عن طريق التسخين عند 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. قبل حضانة العينات ذات التشطيبات الفوسفاتيز ، قم بإعداد عينات من نفس التركيز دون إضافة الفوسفاتيز للمقارنة مع العينات المعالجة بالفوسفاتيز.
  4. أضف المخزن المؤقت لتحميل الهلام 4X SDS المحضر حديثا والذي يحتوي على 400 ملي مولار DTT.
  5. احتضان العينات على كتلة حرارية عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 10-15 دقيقة.
  6. قم بتجميع نظام الرحلان الكهربائي لتشغيل هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪ بواسطة SDS-PAGE.
    1. قم بتحميل 10 ميكروغرام من البروتين (عينة 13 ميكرولتر) لكل بئر على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪. قم بتحميل سلم الوزن الجزيئي.
    2. بعد تحميل العينة ، قم بتوصيل الأقطاب الموجبة والسالبة لنظام الرحلان الكهربائي بمصدر طاقة للحفاظ على جهد ثابت. في البداية ، ابدأ من 70 فولت لمدة 20 دقيقة لنقل عينات البروتين من هلام التكديس إلى جل الحل. بعد ذلك ، قم بزيادة الجهد إلى 125 فولت وقم بتشغيل الجل لمدة 70-120 دقيقة تقريبا حتى تصل العينات وسلم البروتين إلى نهاية الجل.
    3. بعد الانتهاء من الرحلان الكهربائي ، انقل الجل إلى غشاء PVDF باستخدام نظام النشاف الكهربائي الرطب. نقل لمدة ~ 100 دقيقة عند 100 فولت.
    4. ضع علامة على اللطخة عن طريق عمل قطع صغير على جانب سلم الوزن الجزيئي. استخدم لوحا بلاستيكيا شفافا وقاطعا حادا لقطع اللطخة.
  7. قم بسد الغشاء في مخزن مؤقت مانع BSA بنسبة 4٪ لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. احتضان اللطخة في محلول الأجسام المضادة الأولية (مضاد تاو عند 1: 5,000) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. اغسل اللطخة في PBST أربع مرات لمدة 7 دقائق لكل منها.
  9. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة (IgG المضاد للفأر في 1: 5,000) ، واحتضان اللطخة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل في PBST أربع مرات لمدة 7 دقائق لكل منهما.
  10. قم بتطوير اللطخة باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. غطي اللطخة بغلاف بلاستيكي شفاف. الحصول على الصور بواسطة نظام التصوير الكيميائي للتلألؤ الكيميائي باستخدام البرامج ذات الصلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كليات التقنية العليا 116 خلية ATCC سي سي إل -247 طبق 100 مم كورنينج 430161 MEM (EBSS) هيكلون SH30024.01 مصل الأبقار الجنينية (FBS) ثيرموفيشر (جيبكو) 16000044 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية الجسم المضاد لتاو 13 أبكام AB19030 ديثيوثريتول (DTT) روش 10 708 984 001 درجة حرارة التخزين 2-8 درجة مئوية كركم سيجما ألدريتش (فلوكا) 78246 درجة حرارة التخزين 2-8 درجة مئوية الجسم المضاد للتاو (phospho S396) أبكام AB109390 FastAP الفوسفاتيز القلوي الحساس للحرارة الترمو: العلمية إف 0651 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية PMSF سيغما ص 7626 يحفظ في درجة حرارة الغرفة كوكتيل مثبط الفوسفاتيز إشارات الخلية 5870 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية كوكتيل مثبط البروتياز إشارات الخلية 5871 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية الماعز المضاد للفأر IgG الجسم المضاد الثانوي ثيرموفيشر أ -11005 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) أفيميتريكس 75819 التصوير الجزيئي بيو راد ChemiDoc XRS + يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية RIPA المخزن المؤقت سيغما ص 0278 درجة حرارة التخزين 2-8 درجة مئوية تريتون X-100 سيجما ألدريتش س - 100 يحفظ في حوالي 25 درجة مئوية غشاء PVDF بيو راد 162-0177 الماعز المضاد للفأر IgG الجسم المضاد الثانوي ثيرموفيشر أ -11005 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) أفيميتريكس 75819 كاشف صبغة فحص البروتين بيو راد 500-0006 سونيك ديمبراتور فيشر ساينتيك نموذج 500 أجهزة الطرد المركزي ميكرولتر هيتيتش زينتريفوجين ميكرو 200 ص

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS PAGE

مقالات ذات صلة