من أجل دراسة التعبير الجيني في أنسجة الجناح العذراء من anynana Bicyclus ، نقدم بروتوكول الأمثل لفي الموقع التهجين باستخدام riboprobes. كما نقوم بتوفير مبادئ توجيهية لمزيد من التحسين على هذا البروتوكول لاستخدامها في أجنحة العذراء الأنواع Lepidopteran الأخرى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في البروتوكول الموقع للأجنحة الفراشة العذراء طريق Riboprobes
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هنا نقدم ، في شكل شرائط فيديو ، وبروتوكول لالتهجين في الموقع في أجنحة العذراء من anynana Bicyclus فراشة riboprobes به. التهجين في الموقع ، وهي الدعامة الأساسية لعلم الأحياء التطوري ومفيدة لدراسة الأنماط المكانية والزمانية في التعبير الجيني في أنسجة النامية على مستوى النسخ. إذا الأجسام المضادة التي تستهدف منتجات البروتين من النسخ الجيني لم يتم تطويرها ، و / أو وجود نسخ متعددة من الجينات بروتين معين في الخريطة الوراثية البشرية التي لا يمكن أن تكون متباينة باستخدام الاجسام المضادة المتوفرة ، يمكن أن تستخدم في مكان المال بدلا من ذلك. في حين أن الوضع الطبيعي للتقنية أقراص الجناح اليرقات كانت متاحة للمجتمع فراشة لعدة سنوات ، وقد تم تحسين البروتوكول الحالي لأجنحة العذراء أكبر وأكثر هشاشة.
البروتوكول
DAY 1
- إعداد الحلول التالية :
- 10X PBS
- 1X PBS
- 1X PBT
- DDH 2 O
- إضافة DEPC عن الحجم الكلي 0.1 ٪ ويهز الحلول بقوة.
- الأوتوكلاف.
- 4 ٪ لامتصاص العرق فيكس -- باستخدام برنامج تلفزيوني ، DEPC
- بروتين K الحل -- إذا كان موجودا متعجل ، دوامة بقوة قبل إزالة قسامة
- الهضم إيقاف مؤقت
- Prehybridization العازلة
- 50:50 PBT : الاحتياطي Prehybridization
- التهجين العازلة
- يجب أن تبقى الحلول ريبونوكلياز خالية. إما استخدام الزجاج وير التي تم خبز (4 ساعات بمعدل 250 درجة مئوية) أو البلاستيكية. ماصات المصلية مفيدة جدا لصنع ما يصل حلول
- تشريح أجنحة من الوقت قام الشرانق في برنامج تلفزيوني
- الانتقال مباشرة إلى الأجنحة إصلاح الاحتياطي في الآبار من 24 لوحة الثقافة جيدا في درجة حرارة الغرفة
- الإصلاح أقراص لمدة 2 ساعة
- يغسل 5 × 5 دقائق في PBT
- احتضان أجنحة لمدة 3 دقائق في محلول K بروتيناز
- شطف 2 x في مخزن إيقاف الهضم
- يغسل 5 × 5 دقائق في PBT
- غسل 2 × 5 دقائق في PBT 50:50 : PHB
- يغسل 1 × 10 دقيقة في PHB
- احتضان في ساعة ما لا يقل عن 1 PHB في 55 درجة مئوية.
- الحرارة تفسد RNA التحقيق (20 50ng اللازمة لكل بئر) (80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) وإضافة إلى تهجين العازلة (100 ميكرولتر اللازمة لكل بئر)
- إضافة إلى التحقيق الآبار واحتضان 48 ساعة عند 55 درجة مئوية
اليوم 3
- يغسل 4 × 5 دقائق في درجة حرارة 55 مئوية PHB
- بين عشية وضحاها في احتضان PHB عند 55 درجة مئوية
اليوم 4
- إعداد الحلول التالية :
- الأضداد كتلة عازلة
- يغسل 1 × 5 دقائق في PBT 50:50 : PHB
- يغسل 4 × 5 دقائق في PBT
- أجنحة احتضان لمدة 1 ساعة في مخزن في بلوك 4 درجات مئوية
- احتضان أجنحة في التخفيف 1:2000 المضادة للحفر الأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية
يوم 5
- إعداد الحلول التالية :
- الكشف عن مخزن
- الحل النامية -- (التفاف في احباط) الضوء الحساسة
- تغسل 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في PBT
- يغسل 7 × 5 دقائق في PBT
- شطف جناحي مرات في الكشف عن مخزن
- تطوير أجنحة في 1 مل من محلول النامية -- يجب مراقبة الوقت للتنمية في كل مرة -- مرة النامية يمكن أن تتغير حتى عند استخدام نفس تحقيقات والحل النامية -- الاختيار عادة بعد 5-10 دقائق ثم زيادة فترات تصل إلى بين عشية وضحاها. وينبغي أن تكون ملفوفة في احباط لوحة لمنع التعرض للضوء عند عدم التحقق من العينات.
- شطف خمس مرات في إيقاف مؤقت النامية
- جبل الأجنحة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعظيم الاستفادة من البروتوكولات القائمة
التهجين في الموقع على أقراص الجناح اليرقات أجريت بنجاح باستخدام أقراص من الفراشات coenia نبذة (كارول وآخرون 1994 ؛. كيز وآخرون 1999 ؛. Weatherbee وآخرون 1999). وقد تم تكييف البروتوكول الحالي من بروتوكول الخطية المفصلة متوفرة عند الطلب من مختبر لكارول stainings الجناح اليرقات. التغييرات التي قطعناها على أنفسنا خدمة لاستيعاب الاختلافات بين الأنسجة الجناح اليرقات والعذراء. أثناء تشريح hindwing العذراء ، ينبغي إزالة غش...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
نشكر جين Selegue ، هولينجسورث مارغريت ، بيري جين ، Futahashi ريو ، Najmus محفوظ سحر Popadic الكسندر بوب ريد ، روش الدعم الفني للحصول على مساعدة في استكشاف هذا البروتوكول. ونحن نشكر أيضا وليم Piel للحصول على المشورة حول تحرير الفيلم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| محلول التثبيت المنظم | 4% بارافورمالدهيد في محلول PBS | |||
| بولي بوتيلين تيريفثاليت | 0.1% Tween 20 في محلول PBS | |||
| محلول البروتي]]))ناز ك (Proteinase K) | 2.5mجم/مل من البروتينيز ك (Proteinase K) في محلول PBT | |||
| محلول إيقاف الهضم المنظم | 2 مجم/مل من الجلايسين في محلول PBT | |||
| محلول منظم ما قبل التهجين | لتحضير 50 مل من محلول PHB: 12 مل من الماء المعالج بـ DEPC + 25 مل من الفورماميد (Formamide) + 12.5 مل من محلول SSC بتركيز 20x + 50 ميكرولتر من Tween 20 + 500 ميكرولتر من Sperm salmon بتركيز 10 مجم/مل (خالٍ من Rnase، ومُمسَّخ حرارياً قبل إضافته إلى المحلول). | |||
| محلول التهجين المنظم | أضف 1 مجم/مل من الجليكوجين إلى محلول منظم ما قبل التهجين | |||
| محلول الحجب المؤقت | 50 ميليمولار تريس بأس هيدروجيني 6.8، 150 ميليمولار كلوريد الصوديوم، 0.5% إيجيبال (NP40)، 5 ملغم/مل ألبومين المصل البقري | |||
| مضاد-DIG | جسم مضاد | مجموعة روش | 11 093 274 910 | مقترن بالفوسفاتاز القلوي |
| مجموعة محاليل الغسيل والحجب لـ DIG | مجموعة روش (Roche Group) | 11 585 762 001 | ||
| وسط تثبيت مائي Crystal Mount | Sigma-Aldrich | C0612 | وسط التثبيت |
المراجع
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
