Method Article

دراسة آثار تصلب مصفوفة على وظيفة الخلوية باستخدام الأكريلاميد المستندة الهلاميات المائية

DOI:

10.3791/2089

⸱

August 10th, 2010

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تكون على غرار تأثير على وظيفة صلابة الطبقات التحتية الخلوية في المختبر استخدام الهلاميات المائية بولي أكريلاميد متفاوتة التوافق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصلب الأنسجة عاملا هاما في تحديد وظيفة الخلوية ، وترتبط عادة التغيرات في تصلب الأنسجة مع السرطان ، والتليف الرئوي وأمراض القلب والشرايين 11/01. نهج الخلية البيولوجية التقليدية لدراسة وظيفة الخلوية تنطوي على زراعة الخلايا التحتية الصلبة (الأطباق البلاستيك أو الزجاج coverslips) والتي لا يمكن حساب لتأثير وجود مرونة ECM أو الاختلافات في تصلب الأنسجة بين ECM. لنموذج في الجسم الحي شروط الامتثال الأنسجة في المختبر ، ونحن وآخرون استخدام ECM المغلفة الهلاميات المائية. في مختبرنا ، تستند على بولي أكريلاميد الهلاميات المائية التي يمكن أن تحاكي مجموعة من التوافق الأنسجة البيولوجية المشاهدة 12. يتم إنشاء "رد الفعل" زلات تغطية الحضانة مع هيدروكسيد الصوديوم التي تليها إضافة APTMS - 3. يستخدم غلوتارالدهيد العابرة للربط 3 APTMS وهلام بولي أكريلاميد. يستخدم محلول من مادة الأكريلاميد (ميلان) ، مكررا الأكريلاميد (BIS - AC) وبيرسلفات الأمونيوم للبلمرة من هيدروجيل. أدرج N - hydroxysuccinimide (NHS) في حل التيار المتردد لبروتين ECM تشعبي إلى هيدروجيل. بعد البلمرة لهيدروجيل ، وهي مغلفة سطح هلام مع البروتين ECM اختيار مثل فبرونيكتين الكولاجين ، vitronectin ، الخ.

ويمكن تحديد صلابة من هيدروجيل الريولوجيا أو بواسطة المجهر القوة الذرية (AFM) وتعديلها من خلال تغيير نسبة AC و / أو مكررا AC - 12 في الحل. بهذه الطريقة ، يمكن أن تكون مطابقة صلابة التحتية للتصلب الأنسجة البيولوجية التي يمكن أيضا أن يكون كميا أو باستخدام الريولوجيا فؤاد. ويمكن عندئذ أن تكون خلايا المصنف على هذه الهلاميات المائية وتربيتها على أساس الظروف التجريبية المطلوبة. تصوير الخلايا وشفائهم للتحليل الجزيئي واضح ومباشر. لهذه المقالة ، أن نحدد الطبقات التحتية لينة ومرنة وجود تلك moduli (E) <3000 باسكال والطبقات التحتية تيبس / مثل تلك الأنسجة مع E> 20000 باسكال.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد

  • يجب تعقيمها Coverslips.
  • وينبغي استخدام معقم أو منزوع الأيونات الماء المقطر لإعداد الحلول وcoverslips الغسيل.
  • ميلان (40 ٪ W / V) ومكررا - AC (1 ٪ ث / ت) يتم تعقيم الحلول عن طريق الترشيح ميكرومتر 0.2. إعداد 10 ٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS ؛ 100μg/ml المياه) قبل وقت قصير من استخدامها وتصفية العقيمة. حل محل وكالة الأنباء الجزائرية الشهرية.
  • يتم الاحتفاظ الكواشف الكيماوية مثل APTMS - 3 ، الكلور....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وثمة عنصر حاسم في عملية البلمرة هيدروجيل لتجنب تشكيل فقاعة الهواء التي تسمح الخلايا لربط ساترة الزجاج بدلا من هيدروجيل ECM المغلفة نفسها. ويمكن منع ذلك عن طريق حل pipetting بعناية بعد البلمرة vortexing البصر ، وجعل على يقين من أي فقاعات هواء أصبحت المحاصرين في هلام. كنا دائما ننصح إعداد "رد الفعل" إضافية coverslips والهلاميات المائية لضمان وجود ما يكفي للتجريب.

وينبغي إيلاء اهتمام خاص كلما غسل المواد ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العمل هو معتمد مختبرنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
جلوتارالديهايد ، 70٪Sigma-AldrichG7776Store في -20 ° ؛ C
3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97٪)Sigma-Aldrich281778يخزنها في درجة حرارة الغرفة
SurfaSil Siliconizing FluidThermo Fisher Scientific، Inc.42800يخزن في درجة حرارة الغرفة
NHS (N-hydroxysucinimide Ester)Sigma-AldrichA-8060Store at 4 ° C استبدال
الألبومين الشهري ، مصل البقر ، الخالي من الأحماض الدهنيةبشكل أساسي Sigma-AldrichA6003-100GStore at 4 ° ؛ أغطية C
(25 مم)فيشر سيانتيفك12-545-86 25 Cir 1D
أغطية (18 مم)فيشر ساينتفيك12-545-84 18 Cir 1D

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
  2. Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibros....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Acrylamide HydrogelsMatrix StiffnessCellular FunctionExtracellular MatrixReactive Cover SlipsGlutaraldehyde Cross linkingNHS SolutionFibronectin CoatingRheology AnalysisAtomic Force Microscopy

Related Articles