يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التعبير ، Solubilization منظفات ، وتنقية من الناقل الأغشية ، ومقاومة الأدوية المتعددة MexB البروتين

22.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/2134

⸱

ديسمبر 3, 2010

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois Chicago - UIC

في هذه المقالة

ملخص

في هذا البروتوكول نظهر التعبير ، solubilization ، وتنقيتها من بروتين الغشاء أعرب recombinantly ، MexB ، ومجمع للذوبان البروتين المنظفات. MexB هو غشاء المقاومة للأدوية المتعددة من نقل البكتيريا الانتهازية الزائفة الزنجارية الممرض.

الملخص

المقاومة للأدوية المتعددة (MDR) ، وقدرة الخلايا السرطانية أو الممرض أن تكون مقاومة لطائفة واسعة من الأدوية المضادة للسرطان هيكليا ووظيفيا لا علاقة لها أو المضادات الحيوية ، هي مشكلة الخطيرة الراهنة في مجال الصحة العامة. هذه المقاومة لأدوية متعددة يرجع الى حد كبير على الطاقة التي تعتمد على المضخات هروب المخدرات. مضخات طرد الأدوية المضادة للسرطان أو المضادات الحيوية في الوسط الخارجي ، وخفض تركيزها داخل الخلايا دون عتبة السمية. نحن ندرس المقاومة للأدوية المتعددة في الزائفة الزنجارية ، وهو ممرض الانتهازية التي تسبب الالتهابات البكتيرية في المرضى الذين يعانون من أنواع عديدة من الإصابات أو المرض ، على سبيل المثال ، والحروق أو التليف الكيسي ، وكذلك في المناعية للخطر غسيل الكلى والسرطان وزرع الأعضاء والمرضى. وهروب رأس المال في المضخات الرئيسية MDR P. الزنجارية والمجمعات ثلاثية تتكون من بروتون antiporter الداخلية الغشاء المخدرات (التجمع الوطني الديمقراطي) ، وهي قناة الغشاء الخارجي (OMF) ، وبروتين رابط محيط بالجبلة (MFP) 1-8. التجمع الوطني الديمقراطي والبروتينات هي بروتينات عبر الغشاء OMF. البروتينات عبر الغشاء يشكلون أكثر من 30 ٪ من جميع البروتينات ونسبة 65 ٪ من الأهداف المخدرات الحالي. المجالات عبر الغشاء مسعور جعل البروتينات غير قابلة للذوبان في المخزن مائي. قبل أن تتمكن من البروتين النقي عبر الغشاء ، فمن الضروري ايجاد الظروف العازلة التي تحتوي على المنظفات اللطيفة التي تمكن من solubilized البروتين وبروتين معقد المنظفات (PDC) 9-11. في هذا المثال ، نستخدم البروتينات التجمع الوطني الديمقراطي ، وP. نقل عبر الغشاء MexB الزنجارية ، لشرح كيفية التعبير عن المؤتلف شكلا من بروتين عبر الغشاء ، solubilize باستخدام المنظفات ، ومن ثم تنقية البروتين المجمعات المنظفات. ويمكن تطبيق هذه الطريقة العامة في التعبير ، وتنقية ، وغيرها الكثير من solubilization بروتينات غشاء أعرب recombinantly. ويمكن في وقت لاحق مجمعات البروتين المنظفات تستعمل لوصف أو البيوكيميائية البيوفيزيائية بما في ذلك الأشعة السينية تحديد بنية الكريستال أو دراسات يشابك.

البروتوكول

1. اليوم 1 :

يتم ترميز MexB من الزائفة الزنجارية بواسطة pFB101. وكان تضخيم الجين MexB من P. الزنجارية الحمض النووي الجيني وإدراجه في NdeI والمواقع تقييد XhoI من ناقلات + pET30b. وبناء على بصمة hexahistidine C - المحطة.

  1. يتم استخدام البلازميد لتحويل E. القولونية سلالة C43 (DE3) 12 ، ومطلي من transformants أغار على LB يحتوي على 30 ميكروغرام / مل الكانامايسين.

2. اليوم 2 : الثقافات بين عشية وضحاها :

  1. في المساء ، وتحصين 4 X 3 الثقافات LB مل يحتوي على 30 ميكروغرام / مل الكاناميسين من المستعمرات transformant الطازجة. بدلا من ذلك ، يمكن تلقيح الثقافات من بيرم المجمدة.
    وتزرع هذه الثقافات صغيرة على الأسطوانة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.

3. يوم 3 : النمو 6 ليتر الثقافات :

  1. في الصباح ، واستخدام الثقافات بين عشية وضحاها لتطعيم 150 LB مل يحتوي على 30 ميكروغرام / مل الكانامايسين. تنمو ثقافة في 37 درجة مئوية على شاكر.
  2. في فترة ما بعد الظهر ، واستخدام الثقافة صغيرة لتطعيم 6 × 1L 2XYT وسائل الإعلام التي تحتوي على 30 ميكروغرام / مل الكاناميسين في قوارير Fernbach. (استخدم 25 مل لكل ثقافة لتخفيف 1:40). تنمو الثقافات في 37 درجة مئوية حتى التوصل الى OD 600 من 0،4-0،6 ، على بعد حوالى 1.5 ساعة
  3. عندما تصل كثافة الثقافات السليم ، وحمل بروتين تعبير بإضافة 0.5 مل IPTG 1M. تطرح جميع القوارير مرة أخرى في وشاكر لهم الاستمرار في النمو عند 30 درجة مئوية خلال الليل.

4. اليوم 4 : حصاد الخلايا وتنقية البروتينات :

  1. إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني ، الدناز ، والليزوزيم إلى حلول العازلة على النحو التالي : إلى 50 مل من العازلة إعادة تعليق الخلية ، إضافة DNaseI 10 ملغ (0.1 ملغ / مل تركيز النهائي) (1) ، أكمل مثبط البروتياز EDTA خالية من قرص ، وقليل من الليزوزيم . إلى 60 مل من إعادة تعليق غشاء العازلة ، إضافة مثبط البروتياز 1 قرص. آخر مل 50 من العازلة إعادة تعليق الغشاء ، إضافة مثبط البروتياز 1 قرص. إبقاء جميع الحلول الثلاثة على الجليد.
  2. الطرد المركزي الثقافات و 30 دقيقة 5000 دورة في الدقيقة واسعة النطاق في أجهزة الطرد المركزي لحصاد الخلايا.
  3. Resuspend الخلايا في خلية 100 مل العازلة إعادة تعليق (50 ملي برنامج العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، 2 مم MgCl 2 ، 1 أكمل مثبط البروتياز EDTA خالية من قرص ، 0.1 ملغ / مل الدناز الأول ، قليل من الليزوزيم)
  4. تمرير حل مرتين عن طريق خلية خلية الضغوط الفرنسية على 12000 رطل (762 ضغط جوي). أبقى جمع lysate خلية في زجاجة الباردة على الجليد.
  5. نقل lysate الخلية لأنابيب أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي SS34 لإزالة الحطام خلية لمدة 30 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة عند 4 في الدوار SS - 34 درجة مئوية.
  6. إزالة بعناية طاف في أنابيب Ti647.5 نابذة فائقة السرعة. الطرد المركزي و 50 دقيقة في 40000 دورة في الدقيقة في 4C. تجاهل طاف.
  7. Resuspend وبيليه ، الذي يحتوي على أغشية الخلايا ، وتقريبا. 25 مل من إعادة تعليق غشاء العازلة (50 ملي برنامج العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 1 أكمل مثبط البروتياز EDTA خالية من قرص).
  8. نقل تعليق غشاء لأنبوب الطرد المركزي نظيفة والطرد المركزي في 40000 دورة في الدقيقة في الدوار Ti647.5 لمدة 50 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  9. تجاهل وطاف resuspend وغسلها بيليه في 25 مل الغشاء غشاء العازلة إعادة تعليق (50 ملي برنامج العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 1 أكمل مثبط البروتياز EDTA خالية من قرص).

5. TM البروتين Solublization :

  1. لأغشية معلق (حوالي 25 مل) ، إضافة 6 مل DDM 10 ٪ (نهائي تركيز المنظفات DDM = 2 ٪) روك الخليط في 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
  2. الطرد المركزي الخليط في 40000 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار Ti647.5 لفصل البروتين المنظفات للذوبان المجمعات من البروتينات غير قابلة للذوبان. حفظ طاف ، والذي يحتوي على البروتين المنظفات MexB المجمعات.

6. IMAC :

  1. مزيج طاف الحصول عليها من زيادة ونقصان سرعة عالية تقارب مع حبات مخلب المعادن العازلة معايرتها في إعادة تعليق. لاحتضان 1hr على الأسطوانة في 4 درجات مئوية.
  2. صب المزيج في عمود الجسم خطورة تدفق وتدفق من خلال تجاهل.
  3. غسل العمود مع 20 مل (حجم العمود 10) من الاحتياطي IMAC وتجليد واغسل (50 ملي العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 0.2 ٪ DDM)
  4. أزل البروتين مع العازلة شطف IMAC (50 ملي NAP ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 250 مم إيميدازول ، 0.2 ٪ DDM).
  5. أخذ عينات من 15 ميكرولتر من الكسور شطف ، مزيج من كل منها 15 ميكرولتر 2X العازلة SDS عينة لتحليلها من قبل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد. تدور في microcentrifuge 30sec. تحليل العينات على هلام بولي أكريلاميد SDS 10 ٪ لتقدير حجم ونقاء MexB في كل جزء.
  6. تجمع الكسور التي تحتوي على البروتين المجمعات MexB المنظفات والتركيز المكثف عليها في زيادة ونقصان في 4 درجات مئوية. كن حذرا أن البروتين لا تترسب في هذه الصفحاتفاتر.

7. هلام العمود الترشيح :

  1. قبل يوازن من 12 Superose HL 30/10 العمود مع 24 مل العازلة تشغيل (50 ملي برنامج العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 0.2 ٪ بيتا octylglucoside) ، والانتظار للحصول على خط ثابت.
  2. شطف تحميل نظام Akta حلقة مع العازلة على التوالي.
  3. حل تصفية البروتين باستخدام فلتر حقنة قبل تطبيقه على العمود.
  4. تحميل ما يصل إلى 240 ميكرولتر من محلول البروتين على العمود ، مع تركيز البروتين تصل إلى 5mg / مليلتر.
  5. تشغيل وحدات التخزين العمود 1.5 (36 مل) من المخزن ، وجمع الكسور 0.25 مل. ينبغي للبروتين المجمعات المنظفات MexB أزل باعتبارها ذروة عند حوالي 10-15 مل من حجم شطف.
  6. أخذ عينات 5 ميكرولتر من الكسور الذروة. مزيج كل عينة 01:01 العازلة 2X مع عينة SDS. تحليل العينات على هلام بولي أكريلاميد 10 ٪ لتقدير حجم ونقاء MexB في كل جزء
  7. تجمع الكسور التي تحتوي على MexB النقي.

8. ممثل النتائج :

الشكل 1 يتضمن هلام بولي أكريلاميد مع كسور العمود مجمعة من العمود IMAC وكسور فردية من هلام العمود الترشيح. بعد هلام العمود الترشيح البروتين النقي يظهر من خلال هلام بولي أكريلاميد Coomassie الملون. الرقم 2 ويشمل تتبع من هلام العمود الترشيح تظهر ذروة الرئيسي للمجمع يبلغ حجمه البروتين المنظفات من العمود. متوسط ​​العائد من البروتين MexB حوالي 2 ملغ لكل ليتر من 6 2XYT الثقافة.

الشكل 1
الشكل 1. SDS - PAGE هلام تطهير PDCs MexB. حارة 1 ، علامات الوزن الجزيئي. 2 ، مجمع الكسور IMAC. 3-7 الترشيح الكسور جل العمود.

الشكل 2
الشكل 2. مثال على نتائج الترشيح للمجمعات جل MexB المنظفات البروتين (PDC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بالإضافة إلى أدوية المتعددة المقاومة ، والعديد من الأنشطة الخلوية الحيوية ، بما في ذلك الاتصالات النقل ايون خلية خلية ، والنقل حويصلة ، وصيانة البنية الخلوية ، والتفاعلات المضيف الممرض ، تنطوي على البروتينات التي هي جزء لا يتجزأ في غشاء الخلية. البروتينات عبر الغشاء يشكلون أكثر من 30 ٪ من البروتينات المعروفة والأهداف هي بالنسبة لغالبية الأدوية المستخدمة اليوم. للطي غير لائق أو نشاط البروتينات عبر الغشاء تؤدي إلى أمراض وراثية هامة ، بما في ذلك التليف الكيسي ، ومرض السكري. على الرغم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وقد أيد هذا المشروع من خلال منح لCJJ من مؤسسة العلوم الوطنية وجمعية العلوم الجزيئية البيولوجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول SDS المنظم للعيناتBio-Rad161-0737
سلالة E. coli من نوع C43(DE3)Lucigen60345-1
كبريتات الكانامايسينSigma-AldrichK4378
وسط 2XYTFisher ScientificBP2466-2
وسط LBFisher ScientificAC61189-5000
IPTGSigma-AldrichI6758
DNaseIFisher ScientificBP3226-1
ليزوزيمSigma-AldrichL7651
أقراص مثبطة للبروتياز كاملة وخالية من EDTARoche Group11 873 580 001
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaP monobasic)Sigma-AldrichS6566
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (NaP dibasic)Sigma-AldrichS5136
NaClSigma-AldrichS6191
MgCl2Sigma-AldrichM1028
جليسرولFisher ScientificBP229-1
n-dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310
أنابيب سعة 15mlCorning430052
هزاز See-Saw RockerFisher ScientificSSL 4
راتينج Talon للألفة المعدنيةClontech Laboratories635503
إيميدازولSigma-AldrichI5513
هلامات SDS PAGE بولي أكريلاميد بتركيز 10%Bio-Rad161-1454
محلول تشغيل Tris/glycine/SDS PAGEBio-Rad161-0732
مؤشرات الوزن الجزيئي المصبوغة مسبقاً KaleidascopeBio-Rad161-0324
عمود Superose 12 30/10GE Healthcare12 10/300 GL
مركز طرد مركزي AmiconEMD MilliporeUFC801024
مرشح حقنةFisher ScientificSLFG R04 NL
دوارق فيرنباخ (Fernbach flasks)Fisher Scientific09-552-39
هزاز لحمل دوارق فيرنباخFisher Scientific
نظام AktaGE Healthcare
جهاز طرد مركزي واسع النطاق J6 مع دوار JLA-8.1000Beckman Coulter Inc.
زجاجات طرد مركزي سعة 1 lBeckman Coulter Inc.969329
جهاز طرد مركزي RC-5Thermo Fisher Scientific, Inc.
دوار زاوية ثابتة SS34 وأنابيبThermo Fisher Scientific, Inc.
جهاز طرد مركزي فائق Sorvall موديل أرضيThermo Fisher Scientific, Inc.
دوار T647.5 وأنابيب مع أغطيةThermo Fisher Scientific, Inc.08322
خلية ضغط فرنش (French Pressure Cell)Thermo Fisher Scientific, Inc.FA-032

المراجع

  1. Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
  2. Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
  3. Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
  4. Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
  5. Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
  6. Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
  7. Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
  8. Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
  9. Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
  10. Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
  11. Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
  12. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بروتين MexBتنقية البروتينكروماتوغرافيا الترشيح الهلاميالتنقية باستخدام كروماتوغرافيا تقارب الأيونات المعدنية (IMAC)تحليل الفصل الكهربائي للهلام بتركيز كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE)عزل الغشاءخلية الضغط الفرنسيةالطرد المركزي الفائق
التعبير ، Solubilization منظفات ، وتنقية من الناقل الأغشية ، ومقاومة الأدوية المتعددة MexB البروتين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.