نقدم الإجراء الذي يمكن أن تستخدم ثنائي الأبعاد agarose هلام تحليل لتحديد هيكل وسيطة النسخ التالية التي تحدث للاشعة فوق البنفسجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور الوسطيات المتماثل للأشعة فوق البنفسجية يتسبب في E. القولونية ثنائي الأبعاد باستخدام Agarose جل التحليل
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
النسخ غير دقيقة في وجود الحمض النووي من التلف هي المسؤولة عن غالبية إعادة ترتيب الخلوية والطفرات التي لوحظت في جميع أنواع الخلايا ، ويعتقد على نطاق واسع لتكون مرتبطة مباشرة مع تطور السرطان لدى البشر. الحمض النووي من التلف ، مثل تلك التي تسببها أشعة فوق البنفسجية ، ويضعف بشدة قدرة تكرار لتكرار قالب الجينومية بدقة. وقد تم تحديد عدد من المنتجات التي يتم الجينات المطلوبة عند تكرار اللقاءات آفات الحمض النووي في القالب. ومع ذلك ، فقد كان التحدي المتبقية لتحديد كيفية معالجة هذه الآفات البروتينات أثناء النسخ المتماثل
البروتوكول
1. النمو والإشعاع فوق البنفسجي.
- 200μl ثقافة جديدة بين عشية وضحاها التي تحتوي على البلازميد pBR322 نمت في المتوسط ديفيس 1 تستكمل مع السكر بنسبة 0.4 ٪ ، 0.2 ٪ الأحماض casamino ، و 10 ميكروغرام / مل الثايمين (DGCthy متوسطة) و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسيلين هو المحبب. هو معلق ثم بيليه خلية في المتوسط DGCthy 200μl تفتقر أمبيسلين واستخدامها لتلقيح 20 مل من DGCthy المتوسطة.
- تزرع الثقافات دون انتقاء الأمبيسيلين في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية إلى 600 من OD 0.5 (~ 5 × 10 <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها من خلايا نموذجية النوع البري في حضور وغياب الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها تلف في الشكل 1. في غياب أي ضرر ، ويمكن العثور ~ 1 ٪ من الحمض النووي للبلازميد الإجمالي في قوس Y عندما الخلايا تنمو بسرعة في مرحلة الأسي. بعد التشعيع ، لوحظ زيادة عابرة في شكل جزيئات Y كما منعت تكرار الشوك تتراكم في المواقع المتضررة. وسيطة النسخ X - شكل عابر أيضا تتراكم وتستمر حتى الوقت الذي يرتبط عندما يتم إصلاح الآفات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ويدعم العمل في المختبر لدينا من قبل جائزة التوظيف MCB0551798 من المؤسسة الوطنية للعلوم ومنطقة منحة R15GM86839 من NIGMS - NIH.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مثال على تحليل Southern لهلام ثنائي الأبعاد تم فحصه | GE Healthcare | G15T8 | إضاءة صفراء |
| مصباح مبيد للجراثيم بقدرة 15 μwatt | Sylvania | F20T12/GO | مصباح UV |
| مقياس شدة UV من Blak-Ray بطول موجي 254nm | Daigger | EF28195T | مقياس ضوئي UVC |
| أقراص مسامية بحجم 0.025 μm | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | أقراص دياليز عائمة |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | إنزيم تقييد نوكلياز |
| طقم ترجمة الشق (Nick-translation) | Roche Group | 976776 | لتحضير مسبار موسوم بـ 32P |
| ورق لطخة (Blotting Paper) | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | لنقل Southern |
| غشاء نايلون | GE Healthcare | RPN203S | لنقل Southern |
المراجع
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regres....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
