نحن التفصيل جديد بالقرب من الأشعة تحت الحمراء مضان (NIRF) قسطرة للتصوير 2 الأبعاد الجزيئية داخل الأوعية البيولوجيا البلاك في الجسم الحي. يمكن للقسطرة NIRF تصور العمليات البيولوجية الرئيسية مثل الالتهاب من خلال الإبلاغ عن وجود لوحة ، متعطشا fluorochromes NIR activatable وهادفة. القسطرة يستخدم السريرية الهندسية ومتطلبات السلطة ، واستهداف للتطبيق في الشرايين التاجية البشرية. الدراسة البحثية التالية توضح استراتيجية التصوير المتعدد الوسائط التي تستخدم رواية في الجسم الحي قسطرة NIRF داخل الأوعية الدموية لتحديد الصورة واللوحة التهاب نشط في proteolytically atheromata الأرنب الملتهبة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الجسم الحي الأدنى الإسفار التصوير بالأشعة تحت الحمراء داخل الأوعية (NIRF) الجزيئية من البلاك التهابية ، وهو النهج المتعدد الوسائط إلى التصوير من تصلب الشرايين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد الاستجابة الوعائية للإصابة استجابة التهابية منظمة بدقة، تحفزها تراكمات الخلايا البلعمية داخل جدار الوعاء الدموي، مما يؤدي إلى تراكم لويحات داخل التجويف محملة بالدهون، وتكاثر خلايا العضلات الملساء، وتضيق تدريجي في تجويف الوعاء. ويشكل تكوين هذه اللويحات غير المستقرة والمعرضة للتمزق الأساس في معظم حالات احتشاء عضلة القلب الحاد. ويتم تنظيم هذا الشلال الالتهابي المعقد جزيئياً وخلوياً من خلال استقطاب الخلايا اللمفاوية T والخلايا البلعمية وتأثيراتها المجاورة على الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء.1
تطورت التصويرات الجزيئية في تصلب الشرايين لتصبح أداة سريرية وبحثية هامة تتيح التصوير المرئي in vivo للالتهابات والعمليات البيولوجية الأخرى. وتوضح العديد من الأمثلة الحديثة القدرة على اكتشاف اللويحات عالية الخطورة لدى المرضى، وتقييم آثار العلاجات الدوائية في حالات تصلب الشرايين.4 وبينما يمكن لعدد من مناهج التصوير الجزيئي (خاصة التصوير بالرنين المغناطيسي MRI والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني PET) تصوير الجوانب البيولوجية للأوعية الكبيرة مثل الشرايين السباتية، فإن الخيارات المتاحة لتصوير الشرايين التاجية محدودة.2 وقد أدى ظهور استراتيجيات التصوير البصري عالي الدقة، وخاصة الفلورة بالأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF)، مقترنة بالمجسات الفلورية القابلة للتنشيط، إلى تعزيز الحساسية وتطوير استراتيجيات جديدة داخل الأوعية الدموية لتحسين التصوير البيولوجي لتصلب الشرايين التاجية البشرية.
يعتمد التصوير الجزيئي بالفلورة في الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) على استخدام ضوء إثارة بنطاق عرض محدد (650-900 nm) كمصدر للفوتونات التي، عند توجيهها إلى عامل تباين بصري أو مسبار فلوري، تبعث فلورة في نافذة NIR يمكن اكتشافها باستخدام مرشح انبعاث مناسب وكاميرا ذات شحنة مقترنة عالية الحساسية. وبخلاف الضوء المرئي، يخترق ضوء NIR الأنسجة بعمق، ويكون أقل توهيناً بشكل ملحوظ بواسطة ممتصات الفوتونات الداخلية مثل الهيموغلوبين والدهون والماء، كما يتيح نسباً عالية من الهدف إلى الخلفية نظراً لانخفاض الفلورة الذاتية في نافذة NIR. ويمكن للتصوير ضمن "نافذة" NIR أن يحسن بشكل كبير من إمكانات التصوير الحي (in vivo).2,5
لقد تمت دراسة بروتيازات السيستين الالتهابية بشكل جيد باستخدام مجسات NIRF القابلة للتنشيط10، وهي تؤدي أدواراً مهمة في عملية تكون العصيدة. فمن خلال تحلل المصفوفة خارج الخلية، تساهم بروتيازات السيستين بشكل كبير في تطور مضاعفات تصلب الشرايين8. وبوجه خاص، يتم التعبير عن بروتياز السيستين، كاتيبسين B، بشكل عالٍ ويتواجد في نفس الموقع مع الخلايا البلعمية في لويحات تصلب الشرايين التجريبية لدى الفئران والأرانب والبشر.3,6,7 بالإضافة إلى ذلك، يمكن استشعار نشاط كاتيبسين B في اللويحات in vivo باستخدام تقنية الفلورسنت بالأشعة تحت الحمراء القريبة داخل الأوعية أحادية البعد (1-D) الموصوفة سابقاً6، بالاشتراك مع عامل استشعار نانوي قابل للحقن يتكون من هيكل بوليمري من البولي-لايسين مشتق من عدة كروموفورات فلورية NIR (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA)، مما يؤدي إلى إخماد جزيئي داخلي قوي في الحالة الأساسية.10 وعقب الانقسام الإنزيمي المستهدف بواسطة بروتيازات السيستين مثل كاتيبسين B (المعروف بتواجده في نفس موقع الخلايا البلعمية في اللويحات)، تنفصل الكروموفورات الفلورية، مما يؤدي إلى تضخيم كبير في إشارة NIRF. إن الكشف داخل الأوعية عن إشارة فلورسنت NIR بواسطة قسطرة NIRF المبتكرة ثنائية الأبعاد (2D) المستخدمة يتيح الآن كشفاً عالي الدقة ودقيقاً هندسياً in vivo لنشاط كاتيبسين B في اللويحات الملتهبة.
يُعد التصوير الجزيئي In vivo لتصلب الشرايين باستخدام تصوير NIRF ثنائي الأبعاد القائم على القسطرة، على خلاف نهج التنظير الطيفي أحادي الأبعاد السابق،6 أداة حديثة وواعدة تستفيد من زيادة نشاط البروتياز في اللويحات الغنية بالخلايا البلعمية للكشف عن الالتهابات الوعائية.11,12 يصف بروتوكول البحث التالي استخدام قسطرة NIRF ثنائية الأبعاد داخل الأوعية الدموية لتصوير وتوصيف بنية اللويحات بالاستعانة بالجوانب الرئيسية لبيولوجيا اللويحات. وهي منصة قابلة للتطبيق السريري، وعند دمجها مع تقنيات التصوير السريرية الحالية بما في ذلك تصوير الأوعية والموجات فوق الصوتية داخل الأوعية (IVUS)، فإنها توفر تقنية تصوير جزيئي متكاملة ومتعددة الوسائط، فريدة ومبتكرة، تميز الأورام العصيدية الالتهابية، وتسمح بالكشف عن إشارات NIRF داخل الأوعية في الشرايين التاجية ذات الحجم البشري.
البروتوكول
في نموذج حيواني فيفو : الجيل من تصلب الشرايين التجريبى الأبهرية الحرقفية
1) الأساس تصوير الأوعية الدموية والتعرية بالون
- قبل الحصول على خط الأساس تصوير الأوعية وتعرية البالون ، ويتم تغذية الأرانب البيضاء في نيوزيلندا ارتفاع الكولسترول (1 ٪) نظام غذائي لمدة 1 أسبوع. ويستخدم هذا الحيوان لأهميتها متعدية ك 1) في الأوعية aorto - iliacs في الارانب هي نفس العيار الشرايين التاجية البشرية (2.5 - 3.5mm) و 2) وhyperlipidemic ، البالون الاصابة بتصلب الشرايين ملتهبة نموذج يولد تحمل خلايا التهابية مماثلة (الضامة ) والجزيئات (cathepsins) كما في تصلب الشرايين الإنسان.
- التالية تغذية الكولسترول ، وهذا الحيوان هو تخدير مع البروبوفول والكيتامين. يتم إجراء واحد بوصة الرقبة خط الوسط شق بطني به باستخدام حجم 15 مشرط النصل. باستخدام تقنيات تشريح حادة ، تتعرض عضلات أسفل اللفافة على الجانب الأيمن من القصبة الهوائية. يتم فصل العضلات sternocephalicus اليسار على طول تقاطع في النسيج الضام ، ويتعرض حق الشريان السباتي المشترك. يتم فصل الشريان من العصب المبهم. توضع حلقات خياطة القريبة والبعيدة على الشريان للسماح للتراجع وانسداد. ويرصد 1 إلى 2mm ومشطوف بضع الشريان من خلالها 5 الفرنسية (القطر الخارجي 1.67mm) يتم إدراج غمد الأوعية الدموية والهيبارين (1000μ/mL ، ~ 150units/kg) يدار داخل arterially عبر غمد.
- ثم يتم حقن صبغة تباين (Ultravist) (1 إلى 2mL) على مدى فترة 2 ثانية للحصول على صورة وعائية السيطرة على الأورطى البعيدة على حد سواء والشرايين الحرقفية.
- ثم يصاب في الشرايين الحرقفي الفخذي والشريان الأورطي عن طريق تعرية البطانية. باستخدام أساليب الكشف الفلوري القياسية ، يتم وضع استئصال الصمة فوغارتي 3Fr قسطرة الشريان الحرقفي الفخذي في القاصي وتضخمت مع 0،3-0،5 سم على النقيض من (50 ٪ contrast/50 المالحة ٪) أو الهواء. ثم يتم سحب القسطرة قريب في حالته مضخمة على مسافة طول الحرقفي الأيمن والشريان الأورطي وحشي حتى يحصل على الخروج من الشريان الكلوي الأيسر. بعد تعرية البالون ، يتم تكرار القسطرة للوثيقة سالكية السفينة. بعد القسطرة ، تتم إزالة كافة القسطرة والأغماد وligated والداني الحق الشريان السباتي المشتركة ، وتتم خياطة العضلات واللفافة مع خياطة 4 / 0 للامتصاص ، وشق الجلد مغلقة مع خياطة غير قابل للامتصاص 4 / 0.
- ثم يسمح للحيوان لاسترداد مع ادارة جرعة من المضادات الحيوية واحد (Cephazolin ، 0.5 غرام IM). ألم الأدوية بما في ذلك 0.01 IM البوبرينورفين ملغ / كلغ (مرتين يوميا حسب الحاجة). ثم واصل والحيوانات على الكوليسترول بنسبة 1 ٪ لمدة 4 تعرية بعد بالون أسابيع. في الأسبوع 5 ، وانتقلت الحيوانات لحمية الكولسترول بنسبة 0.3 ٪.
متكامل متعدد الوسائط تصوير Atheromata أرنب
2) بطاقات المواد الملتهبة لوحة النشطة proteolytically باستخدام حقن nanosensor ؛ تصوير الأوعية الدموية والموجات فوق الصوتية داخل الأوعية (IVUS) ، والتصوير في فيفو NIRF داخل الأوعية عصيدة من أرنب
- ثمانية أسابيع بعد اصابة في بالون و 24 ساعة قبل التصوير ، ويتم حقن في الوريد مع الأرنب Prosense/VM110 nmol / كغ 500 (PerkinElmer) عن طريق الوريد الأذن.
- أربع وعشرين ساعة بعد الحقن ، وتخدير الحيوانات والتي تم الحصول عليها عن طريق الوصول الشرايين السباتية الشريان اليسار الموحد (انظر الخطوة 1.2). يدار داخل الشرايين الهيبارين (150 وحدة / كلغ). يتم الحصول على خط الأساس القسطرة على النحو الوارد أعلاه.
- يتم تحميل لقسطرة IVUS على سريري سلك الشريان التاجي 0.014 بوصة وقادرة على إدراجها في غمد. التوجيه باستخدام جهاز أشعة ، يتم وضع الطرف ظليل للأشعة السلك بشكل أقصى في الشريان الحرقفي الأيمن. متقدمة ثم IVUS القسطرة في الشريان الحرقفي القريبة باستخدام معيار تقنية المونوريل السريرية.
- وبدأ التراجع 100 ملم ، وتسجل الصور. يتم الحصول على إعادة الإعمار الطولي للسفينة ويتم تحديد لوحة اللمعية.
- يتم تحميل القسطرة NIRF 11،12 على السلك 0.014 بوصة (المونوريل النظام) ، ويتم إدخال قسطرة بعناية في غمد ورئيس التصوير المتمركزة في الشريان الحرقفي بشكل أقصى اليمين.
- يتم تنفيذ الانسحاب الآلي متعددة (1 ملم / ثانية انسحاب طولية ، و 30 طلقة في الدقيقة الواحدة) ، وأشار إشارات مضان داخل مناطق من تصلب الشرايين. وتسجل الصور وتحقيق مزيد من المعالجة مع زيادة مناسبة والنوافذ على أساس مجموعة من الإشارات.
3) القتل الرحيم والعزل من الأنسجة السابقين aorto - الحرقفي فيفو
- ويتم إنجاز مع 1cc القتل الرحيم وكيل القتل الرحيم (حل 390mg الصوديوم الصوديوم والفينيتوئين بنتوباربيتال 50mg) ، في الوريد ، حقنة واحدة.
- هو perfused شجرة الشرايين طبيعية مع المالحة 0.9 ٪ حتى الوريد الأجوف السفلي واضح من الدم. يتم تحديد تصلب الشريان الأورطي والشرايين الحرقفية وخالية من تشريح الأنسجة المحيطة بها. بالإضافة إلى ذلك ، صغيرة 2 × 2 سم من القطع لىكما يتم الحصول على النسخة والكلى والطحال والقلب.
- ويمكن أن يتم خارج الحي NIRF التصوير مع قسطرة الأوعية الدموية التصوير NIRF في هذه المرحلة. غير ممدود السفينة والقسطرة NIRF إعادة إدراجها في الشريان الأورطي القريبة حتى يتم وضعه على رأس التصوير في الشريان الحرقفي الأيمن أو التشعب. يتم تنفيذ الانسحاب الآلي متعددة على النحو الوارد أعلاه (انظر 2.6).
4) خارج الحي الإسفار الانعكاس التصوير (جمعة) من الشريان الأورطي والشرايين الحرقفية تشريح
- تشريح الأنسجة وضعت في 10-20 سم مكعب من المياه المالحة العادية ونقلها لتحاليل جمعة (صورة محطة 4000MM كوداك برو ، يعد أول الصحة ، وشركة).
- وممدود الأوعية الحرقفية الشريان الأورطي ، وأطوال الوقت الحقيقي التقريبي ويتم الحصول على الصور في موجات متعددة [الضوء الأبيض ، قناة الفلورية الخضراء (495 نانومتر السابقين ، م 515 نانومتر) ، Cy5 (سابقا 565 نانومتر ، م 670 نانومتر) وCy7 (السابقين 650 نانومتر ، م ن م 760)] قنوات. وتستخدم سلسلة من المرات التعرض لكل طول موجي (0.1 30sec) ويتم تصدير الصور المكتسبة في DICOM أو 16 بت ملفات TIFF unscaled لمزيد من التحليلات. والضوابط الإيجابية والسلبية ، وأجهزة تصوير (الكبد والطحال والكليتين والقلب) في قنوات مماثلة ، ومرات التعرض.
- ويلاحظ زيادة مجالات إشارة في القناة القريبة من الأشعة تحت الحمراء (780nm +) في الشرايين تصلب الشرايين.
5) تضمين الأنسجة لتحليلها وSectioning المناعى
- مناطق طبيعية (غير المصابين الأنسجة ، أي الشريان الحرقفي الأيسر) ويتم تحديد مجالات البلاك وحلقات صغيرة هي جزء لا يتجزأ من النسيج 50-10 ملم في وسائل الإعلام (درجة الحرارة المثلى للقطع) أكتوبر يتم تخزين في كتل -80 C حتى sectioning.
- يتم تنفيذ تقنيات قياسية للتحاليل وsectioning المناعى. وصمة عار الهيماتوكسيلين يوزين ، يتم تنفيذ الرام 11 و تلطيخ كاتيبسين باء.
تحليلات والتكامل المتعدد الوسائط صور (تصوير الأوعية الدموية ، IVUS ، NIRF وجمعة)
6) تجهيز الصور وNIRF جمعة
- DICOM الملفات التي تحتوي على بيانات من التصوير NIRF وجمعة (الذي اتخذ في الأشعة تحت الحمراء القريبة قناة نانومتر 780) يتم معالجتها باستخدام MATLAB الانسحاب والبرمجيات Osirix ، على التوالي. ويتحقق النوافذ المناسبة لعرض مجموعة كاملة من كثافة الإشارة. ويتم تصدير الصور على هيئة ملفات TIFF النهائي.
- يتم استيراد الملفات إلى مستوى برامج لتجهيز الصور (يمكن استخدامها الرئيسي). يتم محاذاة الصور على أساس نقاط مرجعية (أي فقرات على عائية ، التشعب الحرقفي ، والشريان الكلوي). ويتم تحديد مجالات السفينة العادية والبلاك.
- وتتبع يدويا المناطق ذات الاهتمام (ROI) (للالأنسجة الطبيعية ومجالات البلاك) ويتم الحصول على كثافات يعني إشارة باستخدام Osirix وMATLAB ، على التوالي لكل من جمعة والصور NIRF. لتوجيه تتبع المناسبة ، يتم استخدام صورة طولية IVUS السفينة ويتم التعرف عليها بسهولة تحديد الوعاء الطبيعي والبلاك.
- يتم احتساب الهدف إلى الخلفية (تي بي آر) نسب للمناطق البلاك.
ممثل النتائج :
عند الانتهاء من بروتوكول أعلاه ، يمكننا تحديد وتوصيف مجالات النشاط في زيادة كاتيبسين البروتيني وحة التهابات داخل الشريان الأورطي والأوعية الحرقفية. حقن لnanosensor activatable (Prosense/VM110) يتيح لنا التعرف على لوحة proteolytically نشطة. تظهر هذه زاهية أو إشارة مناطق شديدة عندما التقط به جمعة في قناة تحت الحمراء بالقرب من (750 نانومتر). وربط الانسحاب NIRF مع كثافة إشارة بنسبة جمعة والتحالفات مع IVUS التي تسمح بتسجيل الإشارات NIRF التشريحية. حسبت لوحة TBR تم الحصول عليها من جمعة وNIRF مماثلة (انظر الشكل 3 : يعني NIRF TBR 4.2 ، يعني جمعة TBR 2.9). التحليل المناعى لوحة مشرقة يؤكد وجود مكثف للRAM - 11 B كاتيبسين والنشاط في مجالات وحة (لا تظهر البيانات).
الشكل 1. التخطيطي لقسطرة NIRF 2D تمديد السريرية المحتملة لنهج 1D الاستشعار NIRF 6 ، ونحن بناء رواية 2 - D - NIRF القسطرة لتصوير الأوعية الدموية. 11،12 القسطرة ومبنية خصيصا يتكون من الألياف البصرية (125 قطرها ميكرون إيواء أنابيب البولي ايثيلين في : 2.9F) الذي ينير باستخدام الليزر 750 نانومتر مصدر الإثارة. ينبعث ضوء الليزر بزاوية 90 درجة بالنسبة لمحور الألياف. ويستخدم النظام اثنين من المحركات الآلية (التناوب ومتعدية) لتمكين يصاحب التصوير ب 360 درجة وانسحاب الطولي للحصول على التصوير 2D صحيحا. الصور المستخدمة بإذن من المرجع 11.
الشكل 2. التخطيطي يتظاهرون البروتيني بوساطة تفعيل nanosensor ، Prosense/VM110. الصورة المستخدمة بإذن من المرجع 10.
الشكل 3. في الجسم الحي والبلاك TBRs السابقين فيفو (الهدف ، إلى نسب الخلفية)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ملتهبة لويحات ذات المخاطر العالية أو الضعيفة هي المسؤولة المحتمل لغالبية احتشاء عضلة القلب. تحديد مثل هذه اللوحات قبل ظهور الأعراض السريرية له آثار مهمة على حد سواء في توقع نتائج وتوجيه العلاج الطبي. التاجية التقليدية طرائق التصوير الشرياني مثل الأشعة السينية تصوير الأوعية التركيز عادة على توصيف تضيقات اللمعية بدلا من إلقاء الضوء على الملامح الأساسية البيولوجية العالية المخاطر ، والآفات غير تضيقي عادة. داخل الأوعية NIRF التصوير الجزيئي يقدم مختبر قسطرة القلب للترجمة النهج الذي يدم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
FAJ -- مستشار السابقة ، VisEn الطبية ؛ الأتعاب ، وبوسطن العلمية
شكر وتقدير
وقدم الدعم لهذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح # 108229 R01 HL ، جمعية القلب الأميركية للتنمية منح العلماء # 0830352N ، هوارد هيوز الطبي شهادة معهد جائزة التنمية والمشاريع بروادفيف ، وبرنامج الجماعة الأوروبية الإطاري السابع (FP7/2007-2013 بموجب منحة # 235689 الاتفاق) ، ويليام MGH زمالة شراير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Prosense 750 | Visen Medical | VM110 | 500 nmol/kg حقن وريدي |
| هيبارين الصوديوم | APP Pharmaceuticals | 401586D | |
| سيفازولين | NovaPlus | 46015683 | |
| ليدوكائين HCL 2% | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | |
| بوبرينورفين | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 | |
| كيتامين | Hospira Inc. | NDC 0409-2051-05 | |
| نظام غذائي عالي الكوليسترول 1% | Research Diets | C30293 | |
| نظام غذائي عالي الكوليسترول 0.3% | Research Diets | C30255 |
المراجع
- Andersson, J., Libby, P. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clin Immunol. 134, 33-46 (2010).
- Calfon, M. A., Vinegoni, C. Intravascular near-infrared fluorescence molecular imaging of atherosclerosis: toward coronary arterial visualization of biologically high-risk plaques. Journal of Biomedical Optics. 15, 011107-011107 (2010).
- Chen, J., Tung, C. -H. In Vivo Imaging of Proteolytic Activity in Atherosclerosis. Circulation. 105, 2766-2771 (2002).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Molecular Imaging of Cardiovascular Disease. Circulation. 116, 1052-1061 (2007).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Optical and Multimodality Molecular Imaging: Insights Into Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, 1017-1024 (2009).
- Jaffer, F. A., Vinegoni, C. Real-Time Catheter Molecular Sensing of Inflammation in Proteolytically Active Atherosclerosis. Circulation. 118, 1802-1809 (2008).
- Kim, D. -E., Kim, J. -Y. Protease Imaging of Human Atheromata Captures Molecular Information of Atherosclerosis, Complementing Anatomic Imaging. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 449-456 (2010).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Naghavi, M., Libby, P. From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I. Circulation. 108, 1664-1672 (2003).
- Weissleder, R., Tung, C. -H. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotech. 17, 375-375 (1999).
- Razansky, R. N., Rosenthal, A. Near-infrared fluorescence catheter system for two-dimensional intravascular imaging in vivo. Optics Express. 18, 11372-11381 (2010).
- Jaffer, F. A., Calfon, M. A. Two-Dimensional Intravascular Near-Infrared Fluorescence Molecular Imaging of Inflammation in Atherosclerosis and Stent-Induced Vascular Injury. Journal of the American College of Cardiology. 57, 2516-2526 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
