هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من أجنة ذبابة الفاكهة midgastrula المرحلة. آراء الثقافات الحية تظهر الخلايا 1 بعد ساعة من الطلاء ، والخلايا العصبية متباينة بعد 2 أيام من النمو في وسط بيكربونات المستندة إلى المعرفة. والخلايا العصبية كهربائيا منفعل وشكل اتصالات متشابك.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هذا الفيديو يوضح الإجراء لصنع الثقافات العصبية الأولية من أجنة ذبابة الفاكهة midgastrula المرحلة. وأظهرت وسائل لجمع الأجنة وdechorionation وذلك باستخدام مواد التبييض. باستخدام الماصة الزجاج تعلق على الفم أنبوب الشفط ، نحن لتوضيح وإزالة جميع الخلايا من الأجنة واحد. ويتضح من طريقة لتفريق الخلايا من كل embyro إلى انخفاض عدد (5 لتر) متوسطة صغيرة من الزجاج على ساترة غير المصقول. وجهة نظر من خلال المجهر في 1 ساعة بعد الطلاء يوضح كثافة الخلية المفضل. معظم الخلايا التي تزرع في البقاء على قيد الحياة عندما يتم تعريف المتوسطة neuroblasts التي تقسم مرة أو أكثر في الثقافة قبل توسيع العمليات لالتهاب الأعصاب من قبل 12-24 ساعة. وجهة نظر من خلال المجهر يوضح مستوى ثمرة neurite والمتفرعة من المتوقع في ظل ثقافة صحية في 2 أيام في المختبر. تزرع الثقافات في بيكربونات البسيط القائم المتوسطة محددة ، في حاضنة CO 2 5 ٪ إلى 22-24 درجة مئوية. عمليات التهاب الأعصاب مواصلة تطويرها على مدى الأسبوع الأول في الثقافة وعندما اجراء اتصالات مع neurites من الخلايا المجاورة التي غالبا ما تشكل اتصالات متشابك وظيفية. الخلايا العصبية في التعبير عن هذه الثقافات الجهد بوابات الصوديوم والكالسيوم والبوتاسيوم ، وقنوات ومنفعل كهربائيا. ثقافة هذا النظام مفيد لدراسة العوامل الوراثية الجزيئية والبيئية التي تنظم تمايز الخلايا العصبية ، استثارة ، وتشكيل المشبك / وظيفة.
البروتوكول
أولا جمع الأجنة ذبابة الفاكهة
- إعداد لوحات جمع البيض
- يغلي 200 مل درهم 2 O مع آغار ز 8
- تبرد إلى 50 درجة مئوية
- إضافة 2 مل EtOH و2 مل حمض الخليك
- 35 ملم تصب في أطباق بتري بلاستيكية ، قمم
- باردة وتخزينها في حاوية الهواء ضيق عند 4 درجة مئوية
- يجعل ما يقرب من 80 لوحات
- إعداد عجينة الخميرة
- تذوب الخميرة Fleishmans الخبز الناشطة في الماء لتكوين عجينة
- الميكروويف لمدة 20-30 ثانية لتقتل الخميرة (احترس من الغليان فوق)
- متجر في 10 حقنة سم (بدون الإبرة) في 4 أسابيع 2 درجة مئوية لمدة
- الذباب : الكبار استخدامها لجمع البيض عموما الأكثر إنتاجية بين 3 و 14 يوما بعد الناشئة ، وتوفير انهم تمكنوا من الوصول إلى المواد الغذائية الطازجة. وانخفضت مخزونات متحولة العديد من الخصوبة التي يمكن أن يعبر عن نفسه في خفض معدل لوضع البيض وإحداث تغيير في السن التي هي الأكثر إنتاجا. عموما ، عدة مئات من البالغين لجعل السكان البيض الذي وضع جيد.
- الإجراء : انتشار طبقة رقيقة من خميرة العجينة على لوحة جمع بيضة. وهذا يوفر ركيزة مواتية لوضع البيض. الكبار نقل الذباب لجمع البيض زجاجة نظيفة وشريط لوحة جمع إلى فم الزجاجة. لا تترك الذباب في هذه الزجاجات وقتا أطول من 3-4 ساعات كما ترتفع نسبة الرطوبة واجهتك مشكلة الذباب في لصق وعلى جانبي الزجاجة.
II. Dechorionation الجنين مع بليتش
- انشاء قمع بوخنر متصلة قارورة مرشح لتولي الشافطة. وضع قطعة من الورق Whatman 1 # في القمع. مع السحب على التوالي ، ورقة مبللة بالماء المقطر العقيمة.
- شطف أجنة من جمع لوحات على ورقة الترشيح مع تيار من الماء من زجاجة الغسيل.
- شطف لهم في عدة مجلدات من الماء المعقم ، إيقاف الشافطة ، ثم إضافة حجم القمع من المبيض بنسبة 50 ٪. دعونا نجلس البيض 5-10 دقائق. وسيتم حل chorions في 1-2 دقائق ، ولكن يعد لكم ترك الأجنة في التبييض سيتم تدمير أكثر من خميرة تلوث. اقتطاف البالغين أو أي اليرقات التي مشطوف قبالة الطبق.
- شطف الأجنة في طبق بتري معقمة (NOT زراعة الأنسجة) مع الماء المقطر العقيمة. والعديد من الأجنة عصا إلى أسفل الطبق إذا لم يكن قبل المبللة. الشطف عدة مرات مع الماء المعقم في هذا الطبق.
- فحص الأجنة التي تنتقل مع الضوء على اقتطاف الأجنة مرحلة منتصف المعيدة.
III. إعداد الثقافات جنين واحد
- جعل DDM1 (انظر صفات في الفرع الرابع)
- صب الماء قبالة طبق من الأجنة فقط قبل زراعة. الأجنة مع وسائل الاعلام تغطية عقيمة.
- المبينة 3 ، 35 مم أطباق بتري. وضعت في الجولة 4 coverslips تعقيمها في كل طبق. على كل ساترة ، وطرح 5 ميكرولتر من المتوسط. استخدام الزجاج Bellco يؤدي coverslips coverlips المنخفضة.
Bellco البيولوجي زجاجيات
800-257-7043
القط # 1943-00012 - سحب بعض pipets الغرامة إلى حد ما. وسحبت pipets نستخدمها على مجتذب PP - 83 Narishige. أبعاد الدقيق للالماصة ليست حاسمة ، ونحن عادة سحب لهم أدق مما كنا نريد منهم وقطع رأس في نفس المجال للرأي والجنين لقياس الحجم. كنت لا تريد أن تمتص كل من الأجنة في آن واحد ، والخاص لا نريد قمة صغيرة جدا لدرجة ان الامر يستغرق 5 دقائق لامتصاص الخلايا. تهدف لفي مكان ما بين. فحص الأجنة التي تنتقل مع الضوء واستخدام انبوب شفط الفم تعلق على الماصة لإزالة محتويات الجنين. تفريق الخلايا على استعداد لساترة بطرد الخلايا برفق أقرب إلى ساترة ممكن. قد ترغب في النظر في coverslips في أعلى السلطة ، وكذلك تفريق الخلايا في نفس الطريقة.
- السماح للخلايا الجلوس لمدة لا تزيد عن 10 دقائق. الفيضانات الطبق مع وسائل الاعلام وضعت في الحاضنة ، 4-5 ٪ CO 2 البيئة ، إذا به المتوسطة محددة. درجات الحرارة بين 22-24 درجة مئوية. نستخدم عادة 23 درجة مئوية والرطوبة 95 ٪. الرطوبة هو المهم ، كما كنت تريد تجنب التبخر. يمكنك استخدام معيار حاضنة الثدييات وضعت في coldroom مع مجموعة التحكم في درجة الحرارة إلى 23 درجة مئوية.
رابعا. DDM1 المتوسطة محدد لنمو الثقافات
- جعل DMEM : إلى 100 مليليتر من وسائل الإعلام في F12/DME هام (DMEM) (ايرفين العلمية # 9052).
- إضافة Hepes 0،476 ز (20mM) (سيغما # H - 3375). المزيج.
- إضافة 1.25 مل الجلوتامين L - 200 ملم (ايرفين العلمية # 9317). المزيج.
- تصفية في غطاء محرك السيارة مع 0.2 ميكرومتر خلات تصفية حقنة (الحاجة 2 مرشحات).
- 6،64 درجة الحموضة وOSM 288.
- جعل من aliquots 10ML في أنابيب الطرد المركزي 15ml.
- مخزن عند 4 درجة مئوية لمدة أسابيع لا أكثر من 2.
ملاحظة : استخدم دائما تعقيمها الماء المصفى واجري في الحاويات التي محجوزة للإعلام والمكملات فقط. لم يضع القطب درجة الحموضة أو تحريك شريط تستخدم لأغراض أخرى في Media.To جعل DDM1 : إضافة ملاحق المذكورة أدناهلDMEM قبيل زراعة.
- الى 10 مليليتر من إضافة DMEM :
- 100 ميكرولتر ترانسفيرين
- 100 بوتريسين ميكرولتر
- 100 السيلينيوم ميكرولتر
- 100 البروجسترون ميكرولتر
- 50 ميكرولتر الأنسولين
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الثقافات ذبابة الفاكهة المحضرة من الأجنة مرحلة midgastrula الخلايا العصبية تنشأ من neuroblast السلائف ، وكثير منها الفجوة قبل التمايز في المختبر. هذا النظام يوفر بالتالي فرصة فريدة لاستكشاف عوامل وراثية وبيئية مهمة في مراحل مبكرة جدا من تطور الخلايا العصبية (Rohrbaugh وآخرون ، 2003). لقد أظهرنا أن الخلايا العصبية نمت في المتوسط بسيطة محددة تفرق في الخلايا العصبية التي تشكل كهربائيا منفعل أيضا اتصالات متشابك وظيفية (يا داود ، 1995 ؛ لي ودود يا ، 1999). باستخدام التحليل من المسوخ و / أو التلاعب الد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة لمنح NS27501 DKOD. مزيد من الدعم لهذا العمل من المنح أستاذ HHMI إلى DKOD.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
يجب المحافظة على الثقافات المحرز في هذا الإعلام في حاضنة CO2 بحوالي 5 ٪ 22-24 درجة مئوية. نستخدم معيار الثقافة أنسجة الثدييات حاضنة وضعت في غرفة باردة وساخنة إلى 23 درجة مئوية. دائما استخدام الماء المصفى تعقيمها واجري في الحاويات التي هي محفوظة لوسائل الإعلام والمكملات فقط. لم يضع مقياس درجة الحموضة أو تحريك شريط تستخدم لأغراض أخرى في وسائل الإعلام.
المراجع
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).
- Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).
- Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
