وتصف هذه الورقة منهجية لتحديد استجابة الكيميائي من الكريات البيض ليغاندس محددة وتحديد التفاعلات بين مستقبلات سطح الخلية والبروتينات عصاري خلوي باستخدام تقنيات التصوير الخلية الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene 4 الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مستقبلات البروتين يقترن G - (GPCRs) تنتمي إلى عائلة البروتينات عبر الغشاء سبعة والتوسط في تنبيغ من خارج الخلية إشارات إلى استجابات الخلايا. GPCRs تحكم في وظائف مختلفة مثل البيولوجي الكيميائي ، جواني الافراج الكالسيوم ، وتنظيم الجينات بطريقة تعتمد يغند عبر heterotrimeric G - البروتينات 1-2. يجند ملزم يؤدي الى سلسلة من التغييرات متعلق بتكوين يؤدي إلى تفعيل heterotrimeric G - البروتينات التي تعدل مستويات الرسل ثانية مثل الأدينوزين الحلقي الأدينوساين (المخيم) ، اينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) والجلسرين diacyl (DG). بالتزامن مع تفعيل مستقبلات ملزم يجند يبادر أيضا سلسلة من الأحداث للتخفيف من مستقبلات الإشارات عبر عزل ، الحساسية و / أو الداخلي. عملية إزالة التحسس من GPCRs يحدث عن طريق الفسفرة بواسطة مستقبلات مستقبلات كاينيسات G - البروتين (GRKs) وملزمة لاحقة من arrestins β - 3. β - arrestins هي بروتينات عصاري خلوي ونقل من مكان لآخر لغشاء على تنشيط النوع من الاختزال ، ملزم لمستقبلات فسفرته (معظم الحالات) من خلال تسهيل استيعاب هناك مستقبلات 4-6.
Leukotriene ب 4 (LTB 4) هو جزيء الدهون الموالية للالتهابات مشتقة من حمض الأراكيدونيك المسار ويتوسط أعمالها عبر GPCRs ، LTB 4 مستقبلات 1 (BLT1 ؛ مستقبلة تقارب عالية) ومستقبلات LTB 4 2 (BLT2 ؛ مستقبلة تقارب منخفضة ) 7-9. وقد تبين أن 4 - BLT1 LTB الطريق إلى أن تكون حاسمة في الأمراض الالتهابية عدة من بينها ، والتهاب المفاصل والربو وتصلب الشرايين 10-17. توضح هذه الورقة على المنهجيات الموضوعة لرصد LTB 4 - الكريات البيض بفعل الهجرة وتفاعلات مع BLT1 arrestin - β ، وإزفاء مستقبلات في الخلايا الحية باستخدام تقنيات التصوير المجهري 18-19.
وقد تم عزل خلايا نخاع العظام الجذعية المستمدة من C57BL / 6 و الفئران مثقف كما هو موضح سابقا 20-21. وقد اختبرت هذه الخلايا في خلية حية أساليب التصوير لإثبات LTB 4 خلية بفعل الهجرة. وكان الموسومة BLT1 الإنسان مع بروتين فلوري الأحمر (BLT1 - RFP) في محطة C - β arrestin1 والموسومة مع بروتين الفلورية الخضراء (β - ARR - GFP) وtransfected على حد سواء في البلازميدات الجرذ قعد Leukomia (RBL - 2H3) خطوط الخلية 18-19. وتم رصد حركية التفاعل بين هذه البروتينات والتوطين باستخدام المجهر يعيش الفيديو الخلية. المنهجيات الحالية في ورقة تصف استخدام التقنيات المجهرية للتحقيق في الاستجابات الوظيفية للمستقبلات البروتين G - يقترن في الخلايا الحية. هذه الورقة توضح أيضا استخدام البرمجيات Metamorph لقياس كثافة مضان لتحديد حركية مستقبلات البروتين وتفاعلات عصاري خلوي.
البروتوكول
المنهجية
وصف مجهر
أجريت تجارب حية التصوير الخلية باستخدام برنامج التحصين الموسع TE - FM - الإسفار النظام المرفق إلى مجهر مقلوب نيكون الكسوف TE300. المجهر مجهزة مرحلة التسخين. ومرفق تبريد المفاجئة HQ الرقمية B / W CCD (روبر العلمية) والكاميرا الضوئية تصفية 10-2 LAMDA المغير (سوتر شركة الصك) إلى المجهر. يتم التحكم في الإثارة وانبعاث موجات التصفية مع عجلات والتي تسيطر عليها 02/10 لامبا تحكم عجلة التصفية ، ينبغي التعرض سوتر شركة صكوك الوقت 500 مللي تكون كافية لعرض أو طلب تقديم العروض GFP في الخلايا ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التصوير الخلية الحية هي أداة قوية للتدليل على وظيفة وتفاعلات بروتينات معينة كما يحدث في الوقت الحقيقي. الطرق الموضحة في هذه المخطوطة تظهر بوضوح أن LTB 4 يمكن أن تحدث الهجرة السريع للخلايا الجذعية. هذه الأساليب ليس فقط توسيع جوانب مهمة 4 LTB لأنواع الخلايا المتنوعة ، التي تسمح ليتم تطبيقها أساليب مشابهة لمجموعة متنوعة من chemokines الأخرى واختبار فعاليتها وكلاء الكيميائي على السكان فرعية مختلفة الكريات البيض. التصوير مضان في هذا النظام يسمح لرصد الأحداث يشير ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ويدعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI - 52381 ، CA138623 وكنتاكي أبحاث سرطان الرئة المجلس والدعم المؤسسي من جيمس غراهام مركز السرطان براون.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| سلالة خلايا لوكيميا الجرذان القاعدية (RBL-2H3) أو خلايا HEK293. | ATCC | CRL-2256 | |
| ديلبيكو’إيغل المعدل’وسط DMEM (وسط DMEM عالي الجلوكوز) | Invitrogen | 11995 | |
| وسط RPMI أو DMEM الخالي من الفينول الأحمر | Invitrogen | 11835-030 | |
| مصل جنين البقر | Invitrogen | 16000-044 | |
| إل-جلوتامين (200 ملي مولار) | Invitrogen | 25030 | |
| بنسلين-ستريبتومايسين (10000 وحدة/مل) | Invitrogen | 15140 | |
| تريبسين، 0.05% (1X) مع EDTA 4Na، سائل | Invitrogen | 25300 | |
| هيبس (1 مولار) | Invitrogen | 15630 | |
| أطباق Fluoro بقطر 35 مم ومعقمة ذات قاع من الغطاء الزجاجي (بسمك 0.17 مم) (WillCo-dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| كوفيت معقم لجهاز Gene Pulser (فجوة القطب الكهربائي 0.4 سم) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | |
| جهاز التثقيب الكهربائي Gene Pulser II | Bio-Rad | ||
| نظام TE-FM للتفلور فوق البنفسجي الملحق بمجهر Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 المقلوب | أجهزة Nikon | ||
| برنامج Metamorph | التصوير الشامل | ||
| جهاز سحب الماصات الدقيقة الرأسي | ناريشيجي إنترناشيونال (Narishige International) | ||
| Micro-Forge M-900 | ناريشيجي إنترناشيونال (Narishige International) | ||
| المتحكم الدقيق الهيدروليكي MO-188NE | ناريشيجي إنترناشيونال (Narishige International) | ||
| جهاز تحكم يدوي خشن، MN-188NE | ناريشيجي إنترناشيونال (Narishige International) | ||
| <قوي>بنى cDNA: | |||
| الحمض النووي الريبوزي المتمم (cDNA) للمستقبل المقترن بالبروتين G والموسوم ببروتين الفلورسنس الأحمر عند الطرف الكربوكسيلي (hBLT1-RFP) | جالا وآخرون 2005 | ||
| الحمض النووي الريبوزي المتمم (cDNA) لبروتين سيتوبلازمي مُوسوم ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)β-arrestin1-GFP في الدراسة الحالية). | جالا وآخرون 2005 |
المراجع
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved i....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
