النمذجة الأغشية البيولوجية مع لوحات الدوائر الكهربائية وقياس الاشارات في محاور عصبية : تمارين مختبر طالبة

ملخص

هذا هو دليل على أن يفهم كيف يمكن الأغشية البيولوجية باستخدام نماذج الكهربائية. نظهر أيضا إجراءات لتسجيل إمكانات العمل من الحبل البطني العصب من جراد البحر الموجه للمختبرات الطالب.

الملخص

هذا هو دليل على الكيفية التي يمكن أن تستخدم لتوصيف النماذج الكهربائية الأغشية البيولوجية. هذا التمرين أيضا بتقديم المصطلحات المستخدمة في البيوفيزيائية الكهربية. وتستخدم نفس المعدات في النموذج الغشاء كما في التحضيرات حية. يتم التحقيق في بعض خصائص سلك معزول العصب : امكانات عمل الأعصاب ، وتجنيد الخلايا العصبية ، والاستجابة العصبية من الحبل إلى عوامل بيئية.

البروتوكول

1. مقدمة

1.1) خلفية علمية

تُعد المعرفة الأساسية بالدوائر الكهربائية أداة قيمة لفهم وتصور العديد من الجوانب المتعلقة بالتجارب والنظريات الفسيولوجية. يهدف هذا التمرين إلى تعريفك ببعض المبادئ العامة المتعلقة بمصادر الجهد، والمقاومة الكهربائية، والسعة الكهربائية. وتوفر هذه المفاهيم التمهيدية الأساس اللازم لفهم ظواهر مثل النقل التشابكي وانتشار الإشارات الكهربائية على طول الليف العصبي.

كلمة تنبيه: في الدوائر الكهربائية التقليدية اليومية المكونة من أسلاك معدنية ومقاومات، يُحمل التيار بواسطة الإلكترونات التي تحمل شحنة سالبة. أما في الأنظمة البيولوجية، فيُحمل التيار بواسطة الأيونات، والتي قد تحمل شحنة واحدة أو أكثر من الشحنات الموجبة أو السالبة. وحسب الاصطلاح، يتدفق التيار من القطب الموجب إلى السالب (على الرغم من أن الإلكترونات تتحرك في الواقع في الاتجاه المعاكس).

تمثل مكونات الدائرة الخصائص الكهربائية للأنسجة الحية، وفي بعض الحالات، الخصائص الكهربائية للأجسام غير الحية (مثل الأقطاب الكهربائية) المشاركة في دراستها.

أثناء تنفيذ التمرين، قم بتدوين ملاحظات حول النتائج والحسابات.

1.2) المبادئ العامة

تُوصف الخصائص الأساسية للدوائر الكهربائية التي يتدفق فيها تيار مستمر وفقًا لقانون أوم
V = IR
حيث V = الجهد بالفولت (V)
I = التيار بالأمبير (A)
R = المقاومة بالأوم (Ω)

يحكم هذا القانون الجهود التي يتم رصدها في الخلايا العصبية باستخدام الأقطاب الكهربائية. سنقوم أولاً بشرح قانون أوم وتطبيقاته في المواد البيولوجية.

1.3) المواد

عنصر	الكمية
لوحة تجارب (Breadboard)	1
المقاومات: 330 كيلو أوم	1
100 كيلو أوم	12
33 كيلو أوم	6
٢٢ كيلو أوم	1
١٠ كيلو أوم	6
4.7 كيلو أوم	1
٢.٢ كيلو أوم	1
1.5 كيلو أوم	1
1 كيلو أوم	1
٥١٠ أوم	1
330 أوم	1
٢٢٠ أوم	1
150 Ω	1
١٠٠ أوم	1
مكثفات: 0.1 ميكروفاراد	6
١٠ ميكرو فاراد	6
أسلاك	12
PowerLab	1
وصلات مخرج PowerLab	1
أسلاك توصيل مدخلات PowerLab	1
مقياس الجهد الكهربائي (القادر على قياس التيار)	1

مفتاح ترميز المقاومات

اللون	الرقم
أسود	0
بني	1
أحمر	2
برتقالي	3
أصفر	4
أخضر	5
أزرق	6
بنفسجي	7
رمادي	8
أبيض	9
فضي	نسبة تفاوت 10%
ذهبي	نسبة تفاوت 5%

1^{يرجى تقديم النص المراد ترجمته.} النطاق - 1^{يرجى تقديم النص الذي ترغب في ترجمته.} إصبع
2^{لم يتم توفير نص لترجمته. يرجى تزويدي بالنص المصدر باللغة الإنجليزية للبدء في عملية الترجمة.} النطاق - 2^nd رقم
3^{تأخير الشبكية (Retinal Detachment)} النطاق - عدد الأصفار
4^{يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته.} النطاق - التفاوت المسموح به

الشكل 1: إعداد النظام. حاسوب، ولوحة تجارب، وجهاز PowerLab مع محفز مخرجات.

سيعمل نظام PowerLab (واجهة PowerLab من شركة AD Instruments، أستراليا) كمصدر للجهد في هذه التجربة. قم بتوصيل كابل USB الخاص بجهاز PowerLab بالكمبيوتر، وقم بتشغيل PowerLab، ثم افتح برنامج LabChart من سطح المكتب. اختر "New File". ستظهر نافذة تحتوي على قنوات تسجيل متعددة. اختر "Setup" في الأعلى وانقر على "Channel Settings". في الزاوية السفلى اليسرى من النافذة، قم بتقليل عدد القنوات (Number of Channels) إلى 1؛ وفي القناة 1 (Channel 1)، قم بتغيير المدى (Range) إلى 5 V. قم بتوصيل كابل المحفز (Stimulator) المزود بسلكي خطاف صغير (mini-hook leads) بمنافذ الإخراج (Output portals) في جهاز PowerLab: قم بتوصيل كابل الموصل الأحمر بمنفذ الإخراج الموجب وكابل الموصل الأسود بمنفذ الإخراج السالب. بعد ذلك، من الضروري تغيير خرج الطاقة والتردد ومدة النبضة في جهاز PowerLab. وللقيام بذلك، اختر "Setup"، ثم "Stimulator Panel". يتطلب الجزء الأول من التجربة نبضات طويلة بقدر 1.5 V، لذا قم بضبط السعة على 0.75 V؛ وهذا سيعطي مدى قدره 1.5 V (حيث سيصدر PowerLab جهداً يتأرجح بين 0.75 V موجب وسالب). اضبط التردد (0.5 Hz) ومدة النبضة (1 s).

الشكل 2: المخططات التوضيحية للوحة التجارب (Breadboard). تكون الأشرطة الملونة الموجودة على الجوانب متصلة جميعاً كوحدة واحدة لكل لون محدد. أما العمودان الأفقيان في المركز فيكونان متصلين في كل نصف بالنسبة لصف معين، ولكنهما لا يتقاطعان عبر الخط المتوسط أو مع الأشرطة الجانبية. كما أن كل صف في المنتصف يكون مستقلاً عن الصف الذي يليه.

عند استخدام لوحة التجارب (breadboard)، يوجد عمودان على كل جانب يُستخدمان لأسلاك الدخل والخرج. عادةً ما يتم توصيل القطب الموجب بعمود الموجب الموجود على اليمين، حيث تكون جميع الفراغات في هذا العمود متصلة ببعضها. ويتم توصيل الدخل السالب بالجانب المقابل من لوحة التجارب، حيث تكون جميع الفراغات في ذلك العمود متصلة أيضاً. وفي المنتصف، بين مجموعتي الأعمدة، توجد صفوف متعددة تتكون كل منها من خمس خلايا، وتكون كل مجموعة مستقلة عن المجموعات الأخرى. جميع الخلايا في الصف المكون من خمس خلايا تكون متصلة ببعضها ولكنها معزولة عن الصفوف الأخرى. راجع الشكل 2، حيث توضح المناطق المظللة الأجزاء المترابطة في لوحة التجارب. يمكن العثور على فيديو مفيد حول استخدام لوحة التجارب عبر الإنترنت على http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related

التمرين 1

استخدم قانون أوم لحساب التيار المار في الدائرة التالية:

التيار (الشبكة 1): ________________A

التمرين 2
قس الجهد الكهربائي عبر المقاومة، وقيمة مقاومة المقاومة، والتيار المتدفق عبر الدائرة المذكورة أعلاه (الشبكة 1).

الشكل 3: مقياس الجهد Wavetek Meterman.

أعد إنشاء الشبكة 1 على لوحة التجارب (breadboard) باستخدام مقاومة بقيمة 1500 Ω؛ حيث يعمل جهاز PowerLab كمصدر للجهد (1.5 V). تُجرى قياسات الجهد والتيار والمقاومة باستخدام مقياس الجهد (Volt meter). ولكي يجمع مقياس الجهد بيانات دقيقة، يجب أن يكون كل من المسبارين الأحمر والأسود ملامسين للسلك المكشوف في الدائرة. كما يجب ضبط القرص على جهد التيار المستمر (DC voltage) في نطاق مناسب لمقياس أي إعداد تجريبي فردي. لقياس الجهد، ضع كلا مسباري مقياس الجهد عبر طرفي المقاومة. وعند قياس مقاومة المقاومة (وليس هبوط الجهد)، افصل مصدر الجهد، ثم ضع كلا المسبارين مرة أخرى عبر المقاومة. ولقياس التيار، يجب أن يكون مقياس الجهد متصلاً على التوالي في الدائرة؛ مع ملاحظة وجوب توجيه المسبارين الأحمر والأسود بشكل صحيح بالنسبة لتدفق التيار.

الجهد (الشبكة 1): ________________V
المقاومة (الشبكة 1): ________________Ω
التيار (الشبكة 1): ________________A

الآن، باستخدام Power Lab، قم بقياس الجهد عبر الشبكة 2 (وهي مماثلة للشبكة 1، ولكن على لوحة تجارب)، تماماً كما فعلت باستخدام مقياس الجهد. افصل مقياس الجهد وقم بتوصيل أسلاك مسبار قياس الجهد باستخدام المشابك الحمراء والسوداء. بعد ذلك، انتقل لاستخدام المؤشر للنقر على "Channel 1" (في الجانب الأيمن من الشاشة). انقر وانتقل إلى "input amplifier". ثم في الصندوق، انقر على زر "differential" واضبط النطاق على 5 V. انقر على "OK" لحفظ التغييرات.

انقر على "Start" (في الزاوية السفلية اليمنى) لجمع البيانات. يمكن التوقف في أي وقت لقياس انحرافات الجهد. ولقياس الجهد المجمع، انقر على "Stop" واستخدم مؤشر "M" (في الزاوية السفلية اليسرى) وحركه إلى الخط القاعدي عن طريق سحبه. ثم استخدم المؤشر الحر عند قمة تتبع الجهد لقياس السعة. اقرأ التغير في الجهد (ΔV) وسجل البيانات على الورق. يمكنك تأكيد النتائج باستخدام مقياس الجهد المستقل.

1.4) المقاومة والموصلية على التوالي

مبدأ مقسم الجهد: يكون هبوط الجهد عبر مجموع كافة المقاومات الموصلة على التوالي مساوياً لجهد المصدر. ويعتمد الجهد عبر كل مقاومة فردية على نسبة تلك المقاومة من المقاومة الكلية. وبناءً عليه:

سيعمل زوج من المقاومات على تقسيم الجهد بنسبة مقاوماتهما الفردية.

التمرين 3

احسب هبوط الجهد عبر كل مقاومة في الشبكة 3. تحقق من حساباتك عن طريق قياس الجهد الفعلي باستخدام مقياس الجهد وبرنامج Power Lab، مع توصيل مصدر جهد بقيمة 1.5 V.

الشبكة 3. استخدم المقاومتين الموضحتين أعلاه.

محسوب:	مقاس:
الجهد (عبر R1):_______V	الجهد (عبر R1): ________________V
الجهد (عبر R2):_______V	الجهد (عبر R2): ________________V

1.5) تطبيق بيولوجي نموذجي:

توفر الخصائص الكهربائية المختلفة للوسط الداخلي والمحلول الخارجي لخلية عصبية نشطة مثالاً على مقسم الجهد. ويمكن استكشاف هذه الدارة البيولوجية من خلال التسجيلات المأخوذة باستخدام أقطاب كهربائية خارجية. وتعمل المنطقة النشطة من الخلية العصبية، حيث تدخل الأيونات، كمصدر للجهد؛ حيث يتدفق التيار من هذه المنطقة على طول الجزء الداخلي للخلية، ثم يعود عبر المحلول الخارجي. وبالتالي، يوجد تدفق للتيار بين نقطتين من الغشاء يختلفان في الجهد، ويكون هذا التدفق بالضرورة متساوياً داخل الليف العصبي وخارجه؛ وبما أن المقاومة في الداخل أكبر منها في الخارج، فإن أكبر هبوط في الجهد يحدث هنا.

تأمل النظام ودائرته المكافئة (الشكل 4: أ و ب):

الدائرة المكافئة:

الشكل 4: أ (أعلى). التدفق الكهربائي للتيار عبر غشاء خلية بيولوجية. ب (أسفل). الدائرة الكهربائية المكافئة. مصدر الجهد (120 mV) هو الجهد عبر الغشائي الناتج عن جهد الفعل للخلية العصبية.
ملاحظة: R₀ و R_i موجودان فعلياً على التوالي (وليس على التوازي) بسبب موقع مصدر الطاقة. والرسم المكافئ للدائرة هو كما يلي:

الشكل 5: دائرة كهربائية مكافئة بديلة للشكل 4أ.

التمرين 4.
بفرض أن:
V_m، الجهد عبر الغشاء = 120 mV
R_i، مقاومة السائل الداخلي = 10⁶ Ω
R₀، مقاومة السائل الخارجي = 10⁴ Ω
احسب V₀، الجهد بين القطبين A و B.
V₀: ________________V

التمرين 5.

باستخدام الشبكة 4 (انظر أدناه)، قم بقياس الجهود عبر كل مقاومة (R₀ و R_i).
الشبكة 4. صِل مقاومات بقيمة 4.7 K Ω و 10 K Ω على التوالي مع مصدر جهد 1.5 V:

قِس الجهود باستخدام مقياس الجهد (Volt meter).
الجهد (عبر R₀): ________________V
الجهد (عبر R_i): ________________V

الشبكة 5 : مشابهة للشبكة 4، باستثناء أن R₀ = 1 K Ω
لاحظ أنه في الشبكة 5، تكون المقاومة الخارجية أقل بكثير (وهو ما يماثل وجود كمية كبيرة من السوائل أو الأنسجة غير النشطة التي تسبب تحويلاً للمسار بين الأقطاب الكهربائية)، ومن هنا تبرز أهمية التسجيل من الأعصاب في الهواء أو تحت زيت عازل، لزيادة المقاومة الخارجية.
الجهد (عبر R₀): ________________V
الجهد (عبر R_i): ________________V

1.6) المقاومة والموصلية في التوصيل على التوالي والتوازي

مثال على تطبيق بيولوجي:

يعد التكوين الكهربائي للمشبك العصبي ذو النقل الكيميائي مثالاً جيداً على المقاومات المتصلة على التوالي وعلى التوازي. إن النقل الكهربائي غير ممكن عبر معظم المشابك العصبية بسبب تأثير التحويلة (shunting effect) للفجوة المشبكية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذه التحويلة ضرورية على الأرجح للسماح بنشوء جهد كبير عبر الغشاء قبل المشبكي، مما يؤدي بدوره إلى إطلاق الناقل العصبي.

الشكل 6: نموذج للتدفق الكهركيميائي عبر التشابك العصبي.

لاحظ أنه في الأنسجة الحية، تتشكل مقاومات كهربائية كبيرة عند الأغشية وفي المساحات خارج الخلوية المحدودة. أما المساحات السائلة الكبيرة نسبياً، مثل سيتوبلازم الخلية أو محاليل الغمر، فلا تمثل مقاومات كبيرة.

التمرين 6.
تعتبر الشبكة 6 (انظر أعلاه، ولوحة الدوائر) نظيراً للمشبك الكيميائي الناقل. في المشابك الناقلة كهربائياً، يتم إلغاء الفجوة المشبكية (مقاومة التفرع R_s) ويتدفق التيار مباشرة من الخلية قبل المشبكية إلى الخلية بعد المشبكية عبر R_m1 و R_m2، ثم عبر R_m3. يمكن قياس توهين الشبكة بسهولة بقيم مختلفة من المقاومة، مما يوضح التغيرات في المشابك المختلفة. قم بتوصيل جهاز PowerLab الخاص بك بجهد 1.5V (أي ضبط الجهد على 0.75 Volt).

1. قس فرق الجهد (PD) عبر كل مقاومة في الشبكة كما هو موضح، باستخدام جهاز الملتيميتر. سجل قيم المقاومات. دوّن بشكل خاص قيمة فرق الجهد عبر R_m3 (غشاء الخلية بعد التشابكية). الجهد: ________________V
2. استبدل المقاومة بقيمة 330 Ω عند R_s بمقاومة بقيمة 330K Ω. قس فرق الجهد عند R_m3.
3. الآن، مع الإبقاء على R_s بقيمة 330K Ω، استبدل المقاومة بقيمة 330K Ω عند R_m2 بمقاومة بقيمة 33K Ω. قس فرق الجهد عبر R_m3. الجهد: ________________V
4. الآن مع الإبقاء على R_s بقيمة 330K Ω و R_m2 بقيمة 33K Ω، استبدل المقاومة بقيمة 22K Ω عند R _m1 بمقاومة بقيمة 220 Ω. قس فرق الجهد عبر R_m3. الجهد: ________________V

التمرين 7
يظهر مثال على الشبكة المقاومة على التوالي والتوازي عند النظر في خصائص الكابل للألياف العصبية أو العضلية. إن ثابت الطول (LENGTH CONSTANT) لليف هو تلك المسافة التي ينخفض عبرها فرق الجهد (PD) عبر الغشاء إلى 37% من قيمته الأصلية. ويعود هذا التوهين إلى المقاومات الداخلية والخارجية للسائل على جانبي الغشاء والتي يتم تحويلها بواسطة مقاومة الغشاء المستعرضة (العالية نسبياً). وتحدد قيمة هذه المقاومة مدى انتقال الإشارة على طول محور الخلية العصبية. يكون ثابت الطول هو 1/e كما يتم قياسه في حالة الاضمحلال الأسي. dE/dT=-E/RC؛ حيث E هو فرق الجهد، و R هي المقاومة و C هي السعة. أو بصيغة أخرى E=E_oexp (-t/RC)؛ حيث E_o هو جهد البداية و t هو الزمن بالثواني. ويشار أيضاً إلى RC باسم تاو (τ)، وهو الثابت الزمني.

بافتراض أن مقاومة السائل الخارجي مهملة مقارنة بالمقاومات داخل الخلوية ومقاومات الغشاء، يمكن تمثيل الخصائص المقاومة السلبية للغشاء بالدائرة التالية:



الشكل 7: تطبيق الشبكة 7 على إعداد لوحة التجارب.

قم بتطبيق جهد كهربائي عند أحد طرفي الشبكة 7 بين A وB. استخدم جهاز تحفيز، مع اختيار نبضة بمدة 1s، وسعة 1V (مضبوطة على 0.5 V) وتردد 0.75Hz. قم بتوصيل مقياس الجهد عبر كل مقاومة "غشائية" بالترتيب، وسجّل فرق الجهد (PD) عبر تلك المقاومة. اترك أحد طرفي مسبار مقياس الجهد ثابتاً عند (A-lead, Red) بينما يتم نقل الطرف الآخر بالتتابع عبر المواقع من 1-5. قم برسم كل قيمة على رسم بياني لفرق الجهد (PD) مقابل "المسافة" من المصدر، مع اعتبار أن المقاومات الغشائية تفصل بينها مسافة وحدة واحدة. حدد من الرسم البياني ثابت الطول لهذه الدائرة.
رسم بياني لثابت طول الشبكة 7:______________

يتمثل تأثير الزيادة في مقاومة الغشاء المستعرضة، كما يحدث في حالة غمد الميالين، أو النقصان في المقاومة الداخلية الطولية لليفة المرتبط بزيادة قطر الليفة، في تغيير ثابت الطول. إن قيمة المقاومات ليست هي القيم الموجودة فعلياً في محور عصبي، ولكنها تتناسب طردياً تقريباً. وبالمثل، فإن "وحدة المسافة" في النموذج مكبرة بشكل كبير مقارنة بالخلية العصبية الحقيقية.

1.7) السعة الكهربائية

تقوم المكثفات بتخزين الشحنة. إذا تم تطبيق جهد كهربائي على مكثف من خلال مقاومة، يتدفق التيار إلى المكثف، ثم يرتفع فرق الجهد (PD) عبر المكثف بشكل أسي مع مرور الوقت باتجاه فرق جهد المصدر؛ ويعتمد المسار الزمني لهذا التغير في الجهد على الجهد المطبق، والسعة الكهربائية، والمقاومة المتوالية. ويظهر مسار زمني مماثل ولكن معكوس عند تفريغ المكثف.

قم بتوصيل مدخل شبكة المقاومة والمكثف (RC) البسيطة هذه بجهاز التحفيز الخاص بك، عند النقطتين A و B. استخدم نبضات بقوة 1V (مضبوطة على 0.5V) بمدة 1s وتردد 0.75Hz. كما يجب ضبط معدل الحصول على البيانات على 20 K /sec (في الجانب الأيمن من اللوحة). قم بتوصيل مشابك الإدخال من جهاز PowerLab عبر المكثف. ابدأ الجمع لبضع ثوانٍ ثم توقف. استخدم نافذة التكبير (Zoom) لتوسيع زمن الارتفاع في إحدى النبضات المربعة. قد يتطلب التكبير التكرار عدة مرات لتوسيع الأثر. قم بقياس زمن الارتفاع من خط الأساس إلى قمة أثر الجهد عند استقراره تماماً. لاحظ المسار الزمني لتغير الجهد، وتشوّه النبضات المربعة. لاحظ تأثير استبدال المكثف 10μF بمكثف سعته 0.1 μF. من خلال توصيل مسبار الجهد الخاص بجهاز power lab عبر المقاومة، يمكنك ملاحظة المسار الزمني لتدفق التيار عبر الدائرة. اجمع عدداً قليلاً من النبضات فقط ثم توقف للقياس. استخدم المؤشر "M" للانتقال إلى خط الأساس قبل الارتفاع، والمؤشر الحر إلى النقطة التي يبدأ عندها الجهد في الاستقرار.

يتضمن المثال الأخير كلاً من المكونات المقاومية والسعوية. وتتحدد خصائص الكابل الخاملة للألياف العصبية والعضلية بواسطة عناصر مماثلة، تنشأ من خصائص غشاء الخلية. لا توجد مقاومة غشائية مستعرضة في الخلية فحسب، بل توجد أيضاً سعة غشائية، وذلك بسبب الخصائص الكهربائية لغشاء الخلية. ويؤدي ذلك إلى التأثير على المدى الزمني لتطور الجهود المنتشرة إلكتروتونياً.

مثال:

يمكن بناء هذه الشبكة من الشبكة 7 عن طريق توصيل المكثفات المطلوبة على التوازي مع مقاومات الغشاء (Rm).

التمرين 8.
قم بتوصيل المكثفات بسعة 10 μF بالشبكة 7. وباستخدام نبضات من المحفز تبلغ مدتها 1s، وجهدها 1V (ضبط 0.5 V) وترددها 0.75Hz، والتي يجب توصيلها عند A و B، لاحظ التغيرات في الجهد عبر كل مقاومة غشائية. وبافتراض أن جهد "العتبة" (الجهد الذي يتولد عنده جهد فعل في خلية عصبية) هو 0.2V، قم بقياس الوقت المستغرق ليصل الجهد إلى العتبة عند كل مقاومة غشائية. وتعني العتبة هنا قيمة الجهد التي يمكن عندها توليد جهد فعل في خلية حية. قم بتمثيل نتائجك بيانياً كتمثيل للزمن مقابل "المسافة".

الشكل 8: تطبيق الشبكة 9 على إعداد لوحة التجارب.

الرسم البياني للشكل 8.

قم بمحاكاة تأثير انخفاض سعة الغشاء الناتج عن زيادة سمك غمد الميالين من خلال الاستبدال بمكثفات أصغر سعتها 0.1μF. لاحظ التغير في الوقت المستغرق للوصول إلى عتبة التنبيه عند مقاومة مختارة. قم بتركيب البيانات على نفس الرسم البياني الذي يحتوي على المكثفات الأكبر.

فيما يتعلق بغشاء العضلات، يمكن تصور زيادة في السعة الكهربائية نتيجة لزيادة مساحة سطح الغشاء بسبب الأنيبيبات المستعرضة (T-tubules) المرتبطة بها، مما يؤدي إلى سعة غشائية أكبر مقارنة بالعصبون. ويمكن استخدام مكثفات أصغر لتوضيح انخفاض السعة الناتج عن إضافة الميالين إلى محور عصبي غير مياليني. النقطة الرئيسية المطلوب تعلمها هنا هي أن السعة الكهربائية تتناسب طردياً مع مساحة السطح، وعكسياً مع سمك الطبقة العازلة (الميالين) التي تفصل بين "الصفائح" أو أسطح التخزين في المكثف.

تتم ملاحظة الخصائص المعروضة في الدائرة النموذجية في التحضيرات الحية. ومع ذلك، تختلف الخلايا في خصائصها مثل التسرب عبر الغشاء والمقاومة المحورية. كما أن بعض الخلايا لا تولد جهود فعل. ومع ذلك، يتم إنتاج جهد الفعل عندما تكون هناك حاجة لنقل إشارة لمسافة تبلغ بضعة مليمترات لأن الخصائص الكهربائية السلبية للخلايا تؤدي إلى تخميد الإشارات على مدى بضعة مليمترات. وفي السلسلة التالية من التجارب، سيتم توضيح كيفية تسجيل جهود الفعل.

1.8) أسئلة للطلاب

1. ما هي بعض القيم الطبيعية لثابت الطول في الخلايا العصبية والخلايا العضلية؟
2. ماذا يحدث إذا كان الغشاء يتميز بمقاومة غشائية منخفضة: هل سيتغير الثابت الزمني (الوقت اللازم للوصول إلى 63% من القيمة النهائية)؟ إذا كان الأمر كذلك، كيف سيتغير مع انخفاض المقاومة الغشائية؟ وما هي الصيغة الرياضية العامة للثابت الزمني (tau)؟
3. لماذا تستطيع المحاور العصبية الأكبر حجماً، مثل المحور العملاق في الحبار، توصيل الإشارات الكهربائية بشكل أسرع من المحاور الأصغر في نفس تحضيرات الحبار؟

2. خصائص التوصيل في الخلايا العصبية

2.1) من لوحة التجارب إلى الخلايا الحية

إن الخصائص الخاملة التي تم إثباتها في تمارين لوحة الدوائر الكهربائية يمكن قياسها أيضاً في الخلايا الحية؛ ومع ذلك، قد يكون من الصعب استخلاص هذه الخصائص الخاملة عندما تكون مصحوبة بكمونات جهد في الخلايا العصبية. وتتمثل الخصائص النشطة للعصبون في قدرته على الحفاظ على جهد الغشاء الراحة، وتوليد كمونات جهد، وإعادة توليدها على طول الغشاء.

يمكن أن يكون التدفق الكهربائي على طول الحبل العصبي تجدديًا داخل العصبونات الفردية ومن عصبون إلى آخر. في الحبل العصبي البطني (VNC) لسرطان البحر، تتواصل بعض العصبونات عبر الوصلات الفجوية (أي وصلات الفجوات). وكما تم توضيحه في التمارين السابقة باستخدام لوحة التجارب، فإن تغيير المقاومة يمكن أن يعيق توصيل الإشارات الكهربائية. وهذا يشبه تغيير تدفق التيار عبر الوصلات الفجوية داخل الحبل العصبي البطني.

يتم فحص سرعة التوصيل وخصائص أخرى لجهد الفعل المركب في الحبل العصبي البطني (VNC) في السلسلة التالية من التجارب. وسنوضح كيفية الحصول على الحبل العصبي البطني (VNC) لإجراء التجارب، وكيفية تحفيز وقياس الاستجابات باستخدام معدات قياسية مصممة للمختبرات التعليمية للطلاب.

2.2) تحضير جراد البحر

يُعد الحبل العصبي البطني لجراد البحر الأكثر ملاءمة لهذه التجربة. فالعصب سهل التشريح، ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من البروتوكولات التي تؤثر على التوصيل العصبي مع هذه التحضيرة. قبل البدء في هذه التجربة، تعرّف على مصطلحات تشريح جراد البحر الموضحة أدناه:

الشكل 9. مخطط تشريحي عام لجراد البحر.
معدل عن: http://www.enchantedlearning.com

2.3) خلفية عن التوصيل في العصب

يعمل الحبل العصبي البطني في جراد البحر على نقل الإشارات التي تحفز استجابات الهروب، مثل رد فعل ضرب الذيل. وفي هذه التجربة، سيتم أخذ تسجيلات من الحبل العصبي السليم بأكمله. وتتجمع الجهود الفردية من كل عصبون داخل الحبل العصبي لتؤدي إلى نشوء جهد الفعل المركب، والذي يوفر النبضات الكهربائية القابلة للقياس التي يظهرها برنامج التسجيل. ويُعد كل من Erlanger وGasser وBishop (1924) من الرواد الذين وصفوا جهود الفعل المركبة. وتوضح التجربة خصائص فترة الجموح، وسرعة التوصيل، والتأثيرات العصبية لمثبط الفجوات الموصلة 1-heptanol أو درجة الحرارة. إن تعلم المبادئ الأساسية لإشارات الخلايا العصبية يساهم في فهم أفضل للوظائف العصبية بشكل عام (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe and Grundfest, 1961).

2.4) المواد

بند	الكمية
سرطان البحر الكبير (*Procambarus clarkii*)	1
مقصات تشريح دقيقة	1
ملقط	1
MLT016/X غرفة العصب	1
جهاز كمبيوتر محمول مزود ببرنامج المجهر (Scope software)	1
PowerLab	1
مضخم PowerLab	1
كابل مخرج المحفز لجهاز PowerLab	1
موصل PowerLab/الكمبيوتر عبر USB	1
حامل مناور مزود بقطب امتصاص	1
ماصة زجاجية ذات بصيلة	1
كأس من محلول ملحي لسرطان البحر	1

2.5) الطرق

2.5.1) التشريح

تأكد من تحضير طبق الأعصاب والأدوات المختلفة والمحاليل قبل البدء في تشريح جراد البحر.

1. لف جراد البحر في منشفة ورقية مبللة لتثبيته، أو أمسكه بإحدى اليدين بحيث تكون الملاقط (chelipeds) بين الإبهام والسبابة.
2. باستخدام اليد الأخرى، قم بإجراء شق بالمقص عبر المخطم (rostrum) بين محجري العين.
   
3. قص إلى الأسفل من مكان الشق حتى ينفصل الرأس تماماً.
4. قم بإجراء شق عند قاعدة الصدر الرأسي (cephalothorax) فوق البطن؛ ثم أزل الذيل. (إذا لزم الأمر، يمكن إزالة الملاقط وأرجل المشي لتسهيل هذه العملية).
   
5. أزل السباحات (swimmerets).
   
6. قم بإجراء قطع على طول كلا جانبي الجهة البطنية من البطن. احذر من إتلاف الأنسجة العميقة.
   
7. اقشر الجزء المتحرر من الهيكل الخارجي وصولاً إلى قاعدة مروحة الذيل للكشف عن الحبل العصبي البطني.
   
8. باستخدام حافة الملقط، أزل الحبل العصبي البطني بعناية من الطرف. احذر من شد أو سحق الحبل العصبي. (أي عقد تُلاحظ على الحبل العصبي هي عقد عصبية خاصة بجراد البحر).
   
9. مد الحبل العصبي عبر القضبان المعدنية في غرفة العصب. من الضروري الحفاظ على رطوبة الحبل العصبي البطني. ولتحقيق ذلك، أضف كمية كافية من محلول ملحي لجراد البحر إلى غرفة العصب حتى يصل المستوى إلى محاذاة القضبان المعدنية العرضية. بعد ذلك، اسحب كمية كافية من المحلول الملحي باستخدام الماصة بحيث يلامس مستوى السائل فقط القواعد السفلية للقضبان.
   المحلول الملحي لجراد البحر (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl₂.2H₂O; 2.45 MgCl₂.6H₂O; 5 HEPES معدلاً إلى pH 7.4)
10. بمجرد استقرار العصب في مكانه، قم بتوصيل كابل المحفز الذي يحتوي على طرفي خطاف صغير بغرفة العصب. وصل الطرف الأحمر الموجب بأحد الحلقات المعدنية الخارجية القريبة من نهاية الحبل العصبي؛ وصل الطرف الأسود السالب بالحلقة المعدنية المجاورة الأقرب التي لا تزال ملامسة للحبل العصبي.
    
11. ضع قطب الشفط داخل المانيبولاتور بالقرب من الطرف المقابل للعصب.
12. قم بشفط طرف الحبل العصبي البطني بعناية داخل قطب التسجيل.

2.5.2) التسجيل

بمجرد شفط طرف الحبل العصبي داخل قطب التسجيل، تأكد من توصيل القطب بالمجس ومن تأريض المجس بشكل كافٍ. ويمكن تحقيق ذلك ببساطة عن طريق توصيل كابل التأريض بقفص فاراداي. كما يجب توصيل أسلاك قطب الشفط الموجبة والسالبة بالمواقع المقابلة لها في المجس. ويجب توصيل المجس بالمضخم التفاضلي، والذي يتصل بدوره بجهاز PowerLab.

قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية من قطب الشفط إلى مرحلة الرأس (head stage). يجب توصيل الأسلاك بحيث يكون السلك الأحمر (الموجب) في الأعلى جهة اليسار، والأخضر (الأرضي) في المنتصف، والأسود (السالب) في الأسفل. يتضح ذلك في الشكل 10 لمرحلة الرأس أدناه. يمكن وضع السلك الأرضي ببساطة في حمام المحلول الملحي. وبذلك، يتم توصيل سلك واحد من قطب الشفط إلى المدخل + والسلك الآخر إلى المدخل -. ولا يهم أي من أسلاك قطب الشفط يذهب إلى المدخلات + أو -.

الشكل 10: مداخل مرحلة الرأس

إعدادات المضخم هي كما يلي:

التحكم	الإعداد
مرشح تمرير عالي	DC
مرشح ثلمي	إيقاف
مرشح تمرير منخفض	20kHz
تعويض السعة	عكس عقارب الساعة
مقبض الضبط الدقيق والخشن لإزاحة DC	عكس عقارب الساعة
إزاحة DC (+OFF)	إيقاف
مقبض الكسب	50
المدخل (DIFF MONO GND)	DIFF
الوضع (STIM-GATE-REC)	GATE
ΩTEST	إيقاف

قم بتوصيل كابل USB المرفق بالجانب الخلفي من جهاز PowerLab وبمخرج الكمبيوتر. افتح برنامج Scope الموجود على سطح مكتب الكمبيوتر. من أعلى يمين الشاشة، اختر "Channel 2" وقم بإيقاف تشغيله. اضبط الشاشة بحيث تظهر Channel 1 فقط عن طريق سحب الشريط الموجود في منتصف الشاشة إلى الأسفل. بعد ذلك، انقر فوق "Input Amplifier" الخاص بـ channel 1 في أعلى يمين الشاشة. اختر ما يلي:

التحكم	الإعداد
المدى	500 mV
التيار المتردد (AC)	مفعل
مرشح التمرير المنخفض	متوقف
طرف واحد (Single Ended)	مفعل
عكس القطبية	مفعل

بعد ذلك، وتحت قائمة "Set up" مرة أخرى، انقر على "Sampling". وفي المربع المعنون "Sweep" الذي يظهر على الشاشة، حدد ما يلي:

التحكم	الإعداد
الوضع	متعدد
العينة	100 مسح
المصدر	المستخدم
التأخير	0 SECONDS

أخيرًا، من علامة التبويب "Set up"، اختر "Stimulator". انقر فوق المربع لإلغاء تفعيل "Isolated Stim". اختر الإعدادات التالية:

التحكم	الإعداد
الوضع	متعدد
التأخير	5 ms
المدة	1 ms
النبضة (النبضات)	2
الفترة الفاصلة	15 ms
النطاق	5 V
السعة	0.5

راجع "Time Base" في اللوحة اليمنى. غيّر قيمة "Sample" إلى 1024 وقيمة "Time" إلى 200 msec.

الشكل 11: جهدي فعل مركبين مع فاصل زمني قدره 15 msec بين المحفزات كما تم تسجيلهما باستخدام برنامج Scope.

التمرين 1.

اختر زر "Start" في أسفل يسار الشاشة. بناءً على الإعدادات المذكورة أعلاه، يجب أن يظهر جهد فعل مركب محدد بوضوح في مربع جمع بيانات Scope (الشكل 11). ارسم الشكل العام لجهد الفعل على الرسم البياني أدناه (الشكل 12):

الشكل 12: رسم بياني فارغ لرسم شكل جهد الفعل المركب.

قم بخفض الجهد ببطء باستخدام التبويب الموجود في أعلى يسار الشاشة. يجب أن تقل سعة جهد الفعل تدريجياً حتى يختفي نمط الموجة المميز له. يؤدي خفض الجهد إلى تقليل عدد العصبونات التي يتم تجنيدها لإطلاق جهد الفعل المركب. ومن المرجح أن يتم تجنيد المحاور العصبية الأكبر عند الجهود المنخفضة، وهي المحاور الأسرع توصيلاً والتي تميل للظهور أولاً في جهد الفعل المركب. قم بزيادة الجهد تدريجياً لملاحظة التأثير المعاكس؛ فكلما تم تجنيد المزيد من العصبونات، كبر حجم موجة جهد الفعل المركب. يوضح هذا التمرين حقيقة أن العصبونات الفردية لها عتبات مختلفة لإنتاج جهد الفعل. عندما لا يزيد جهد الفعل المركب بعد ذلك مع زيادة جهد التحفيز، يكون قد تم تجنيد جميع العصبونات؛ وعندها يجب أن يظهر ذروتان متمايزتان في موجة جهد الفعل على شاشة الكمبيوتر.

التمرين 2.

بعد فحص تجنيد العصبونات وجهد الفعل المركب الناتج، لاحظ تأثير فترة الجموم. يمكن القيام بذلك عن طريق تقديم محفزين متقاربين زمنياً مع تغيير الفاصل الزمني بين المحفزات، ثم ملاحظة الفاصل الزمني الذي يقل عنده سعة جهد الفعل المركب، الناتج عن المحفز الثاني، مقارنة بجهد الفعل المركب الأول. قم بتغيير التأخير بين النبضات باستخدام التبويب الموجود في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة. استمر في تقصير التأخير حتى لا يمكن استحثاث جهد فعل مركب ثانٍ. إن الوقت بين النبضات الذي لا يتم عنده استحثاث جهد فعل ثانٍ هو فترة الجموم المطلقة. أما الوقت من نهاية فترة الجموم المطلقة إلى الوقت الذي يولد فيه محفز ثانٍ جهد فعل بسعة كاملة فيسمى فترة الجموم النسبية. ضع تقديراً لفترتي الجموم المطلقة والنسبية في المساحات المخصصة.
فترة الجموم المطلقة: ___________________
فترة الجموم النسبية: ___________________

2.5.3) قياس سرعة التوصيل

بواسطة مسطرة مليمترية، قم بقياس المسافة بين سلك التحفيز الأقرب إلى قطب التسجيل وقطب التسجيل نفسه. ومن خلال المخطط المسجل، قم بقياس الزمن اللازم للوصول إلى القمم المختلفة للأحداث في الجهد المركب، حتى تتمكن من تسجيل سرعة التوصيل للإشارات الكهربائية المختلفة. قم بتحويل المسافة من المليمتر إلى المتر، والزمن من الملي ثانية إلى الثانية، لتكون الوحدات بالمتر/ثانية.
1^{يرجى تقديم النص المراد ترجمته.} سرعة التوصيل للشكل الموجي: __________________
2^{لا يوجد نص للترجمة. يرجى تزويدنا بالنص الإنجليزي المطلوب ترجمته.} سرعة التوصيل للشكل الموجي: __________________
3^{بما أن النص المقدم يتكون من حرفين فقط ("rd")، فإنه لا يشكل جملة أو مصطلحاً علمياً محدداً يمكن ترجمته في سياق محتوى JoVE. يرجى تزويدي بالنص الكامل المراد ترجمته لضمان الدقة العلمية واللغوية.} سرعة توصيل شكل الموجة: __________________
4^{يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته.} سرعة التوصيل للشكل الموجي: __________________

2.5.4) التحكم في الوصلات الفجوية و/أو سرعة التوصيل

بعد ذلك، يتم استقصاء خصائص مثبط عصبي. وصف Johnston et al. (1980) لأول مرة تأثير فك الارتباط لمركب الهيبتانول في المحاور المقسمة (أي الموصلات الفجوية) لدى جراد البحر. وسرعان ما تم تأكيد هذا التأثير المتعلق بالتواصل الكهربائي في أنظمة متنوعة من الفقاريات واللافقاريات (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). ولفهم دور التواصل الكهربائي في هذا الحبل العصبي البطني، يمكن استخدام محلول ملحي يحتوي على (1mM) 1-heptanol لفك ارتباط الموصلات الفجوية. وباستخدام ماصة زجاجية، يتم غسل الحبل العصبي بالكامل بمحلول الهيبتانول. ثم تُلاحظ التغيرات التي يسجلها برنامج التسجيل Scope ويتم تلخيصها. (يجب ملاحظة التغير في شكل الموجة، وما إذا كانت سرعة توصيل الأشكال الموجية قد تغيرت). وكبديل لاستخدام 1-heptanol، يمكن استبدال المحلول الملحى الغمري بمحلول ملحي مبرد بالثلج، ومراقبة أي تغير في شكل الموجة أو سرعة توصيل الأشكال الموجية.

المناقشة

هدفنا في عرض الفيديو على الخط والورق وهذا لإثبات أن يمكن ، والخصائص الفيزيائية الحيوية من الخلايا في جزء منه ، كما أن تكون على غرار الدوائر الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، مع الأنسجة العصبية الحية التي يتم الحصول عليها بسهولة نسبيا ، والمبادئ الأساسية للسرعة التوصيل ، وفترات الحرارية وتقنيات التسجيل الكهربية ممكنة للمختبرات الطالب الجامعي باستثمارات متواضعة من المعدات. يمكن أن تكون الموضوعات وقدمت نماذج أساسية تعديل بسهولة لمتطلبات الدورات المختلفة.

الصيانة من جراد البحر ووفرة يجعلها نماذج جذابة للطالب يحركها التجريب. الحبال العصبية البطنية القشريات عموما قوية والاحتفاظ سلامة الفسيولوجية في الحد الأدنى من المياه المالحة لساعات ، وهي كافية لمختبر الطالب 3 ساعات.

بالنظر إلى أن يتم توصيل بعض المحاور الكبيرة في VNC للجراد خلال تقاطعات الفجوة ، ويمكن إجراء تجارب إضافية على مساهمتهم ، وخصائص مختلفة مما يمكن العثور تظاهر في إعداد الضفدع العصب الوركي القياسية. العصب الوركي هو نموذج كلاسيكي لمعالجة إمكانات عمل المجمع وخصائص التوصيل. قد يكون تجربة مثيرة للاهتمام حتى النسبية للطلاب لمقارنة خصائص التوصيل ، والتوظيف محور عصبي ، وفترات الحرارية بين هذه الاستعدادات اثنين.

المواد

مجلس الدارة

1. ويمكن الحصول على الالكترونيات المدرجة أدناه للتجارب اللوح في متجر للالكترونيات محلية مثل راديو شاك.
2. مجلس الخبز والمقاومات والمكثفات والبطاريات والأسلاك التي يمكن أن تكون بمثابة منعطفات للاللوح على النحو المبين في التجارب.
3. والفولتميتر المشتركة (Wavetek Meterman الفولتميتر)
4. لوحة / D للتسجيل على الخط لجهاز كمبيوتر. يتم تسجيل الإشارات الكهربائية على الخط إلى واجهة PowerLab/4s (ADInstruments ، كولورادو سبرينغز ، أول أكسيد الكربون ، الولايات المتحدة). نستخدم البرامج القياسية من ADInstruments اسمه تخطيط أو نطاق.

تجارب الفيزيولوجيا

1. جراد البحر (Procambarus clarkii). Atchafalaya البيولوجي شركة التموين ، Raceland لوس انجليس. ، الولايات المتحدة الأمريكية.
2. جراد البحر المالحة القياسية : من التعديل فان الحل Harreveld في (1936). (مم) 205 كلوريد الصوديوم ؛ بوكل 5.3 ؛ 13.5 CaCl ₂ 2H ₂ O ؛ 2.45 MgCl ₂ 6H ₂ O (5) ؛ HEPES وتعديلها لدرجة الحموضة 7.4. تم الحصول على جميع المواد الكيميائية المالحة من شركة سيغما الكيميائية (سانت لويس ، MO).
3. أدوات تشريح : الجميلة # 5 ملاقط ، مقصات غرامة ، حامل سكين شفرة ، # 26002-20 دبابيس الحشرات (الحصول على جميع العلوم من أدوات الجميلة (الولايات المتحدة) ، وشركة ، 373 - G فخمة بارك محرك ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا 94404-1139)
4. طبق غرفة العصبية (ADInstruments ، كولورادو سبرينغز ، أول أكسيد الكربون ، الولايات المتحدة) لعقد الأعصاب. يمكن استخدام الأسلاك التي تأتي مع العصب طبق الغرفة لتحفيز الأعصاب.
5. يستخدم الشفط الكهربائي لتسجيل الاشارات.
6. سوف تتلاعب أو المشبك على حامل الخاتم بمثابة حامل لالقطب الشفط.
7. قفص فاراداي
8. تشريح مجهر
9. اضاءة عالية الكثافة (مصدر الضوء)
10. منهاج المجهر
11. AC / DC مكبر للصوت التفاضلية (AM النموذجي شركة أنظمة 3000)
12. PowerLab 26T (آلات ميلادي)
13. مكبر للصوت خارج الخلية (صكوك م)
14. LabChart 7 (ADI الآلات)
15. أدوات تشريح
16. حلقة الوقوف والمشبك لتكون بمثابة حامل لتسجيل الشفط الكهربائي