ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لخلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك من الكالسيوم النسخة المنشط الكالسيوم (CRAC) التيارات المحيطية في الدم وحيدات النوى الخلية المستمدة اللمفاويات التائية البشرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خلية كاملة تسجيل النسخة الكالسيوم المنشط الكالسيوم (CRAC) التيارات في الخلايا اللمفية تي الإنسان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الخلايا اللمفية تي ، واستنزاف الكالسيوم من 2 + 2 + الكالسيوم داخل الخلايا يؤدي إلى تخزين تفعيل البلازمي كا 2 + القنوات ، ودعا الكالسيوم النسخة المنشط الكالسيوم (CRAC) القنوات. قنوات CRAC تلعب دورا هاما في تنظيم تكاثر الخلايا T والتعبير الجيني. وقد تم ربط وظيفة غير طبيعي في خلايا CRAC قناة تي الشديدة للأمراض نقص المناعة والجمع بين الذاتية 1 و 2. قد تدرس CRAC ظيفة القناة في الخلايا التائية البشرية كشف الآليات الجزيئية الجديدة التي تنظم الاستجابات المناعية الطبيعية وكشف عن أسباب الأمراض التي تصيب الإنسان ذات الصلة. تسجيلات للتيارات الكهربية غشاء تقديم تقييم أكثر دقة لخصائص قناة الفنية وتنظيمها. أجري أول تقييم للتيارات الكهربية قناة CRAC في الخلايا التائية Jurkat ، تي سرطان الدم البشري خط خلية ، وأكثر من 20 عاما منذ 3 ، ومع ذلك ، والقياسات الحالية في CRAC العادي الخلايا التائية البشرية يظل مهمة صعبة. ومما يزيد من الصعوبات في تسجيل التيارات قناة CRAC في خلايا T العادية من خلال حقيقة أن الدم المستمدة من الخلايا اللمفية تي هي أصغر بكثير في الحجم من الخلايا التائية Jurkat ، وبالتالي ، فإن التيارات الذاتية CRAC كامل الخلية منخفضة للغاية في السعة. هنا ، فإننا نقدم إجراء خطوة بخطوة التي نستخدمها عادة لتسجيل كا 2 + او + نا التيارات عبر قنوات CRAC يستريح الإنسان في الخلايا التائية المعزولة من الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء. وصف الأسلوب هنا اعتمد من الإجراءات المستخدمة لتسجيل والتيارات CRAC في الخلايا التائية Jurkat وتنشيط خلايا T 4-8.
البروتوكول
1. إعداد الخلايا اللمفية تي يستريح الإنسان
- كوكتيل باستخدام RosetteSep T الإنسان إثراء الخلية وRosetteSep متوسطة الكثافة ، وتنقية خلايا تي من عينات دم الإنسان وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وينبغي للسكان الخلية تحتوي على 95 ٪ من الناتج CD3 + الخلايا التائية يستريح. نحن تنقية الخلايا اللمفية تي الإنسان من عينات الدم التي تم جمعها من طرفي متطوعين أصحاء ، وفقا للبروتوكول التي وافق عليها مجلس جامعة كاليفورنيا في ديفيس مراجعة الداخلية.
- بعد العزلة ، resuspend الخلايا التائية يستريح في م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التحقيق التيارات الكهربية في CRAC يستريح الإنسان خلايا T هي مهمة صعبة لأن السعة الحالية CRAC الذاتية في هذه الخلايا غير الصغيرة نظرا لحجم خلية صغيرة (الخلايا التائية يستريح الإنسان القطر في حدود 5-8 ميكرومتر). هنا ، نقدم إجراء خطوة بخطوة لتسجيل موثوق بها التيارات CRAC في الخلايا اللمفية تي يستريح الإنسان معزولة عن الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى. هذه التكنولوجيا تتيح لنا تحقيق في علم وظائف الأعضاء والتعبير الفنية للقنوات CRAC في الخلايا التائية يستريح إلى فهم أفضل لطبيعة الا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون لوزارة فسيولوجيا والأغشية علم الأحياء في جامعة كاليفورنيا ديفيس لتزويدنا مرافق وبيئة ممتازة للدراسات القنوات الأيونية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مزيج RosetteSep لإثراء الخلايا التائية البشرية | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| وسط RosetteSep للكثافة | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| وسط RPMI-in 1640 مع glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| مصل العجل الجنيني | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (محلول 100X) | Invitrogen | 35050 | |
| محلول فيتامينات RPMI 1640 (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| محلول أحماض أمينية 1640 (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| بيروفات الصوديوم | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| إينوزيتول ثلاثي الفوسفات | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| هيدروبروميد بولي-L-لايسين | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| كلوريد اللانثانوم | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| ثابسيغارجين | Calbiochem | 586005 | |
| طقم Sylgard 184 من مطاط السيليكون المرن | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| طلاء HIPEC R6101 الواقي لأشباه الموصلات | Dow Corning | ||
| طاولة مختبر لعزل الاهتزازات عالية الأداء من سلسلة 63-500 | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| مضخم EPC 10 لتثبيت الرقعة مع وحدة رأس | HEKA Instruments | ||
| المتلاعب الدقيق | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| مجهر مقلوب Olympus 1X71 مع عدسة شيئية غمر زيتي 40x | Olympus Corporation | 1X71 | |
| كمبيوتر يعمل بنظام Windows | Dell | ||
| برنامج Pulse | HEKA Instruments | ||
| برنامج Origin للرسم البياني والتحليل العلمي | OriginLab | ||
| جهاز سحب ماصات التثبيت | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| زجاج بوروسيليكات مع فتيل (القطر الخارجي: 1.5mm والقطر الداخلي: 1.10mm) | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| جهاز Microforge من Narashige’s | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| حلقات سيليكون دائرية (O-rings) | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| أغطية شرائح 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
المراجع
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
